基于UPLC指紋圖譜的陳皮飲片及其配方顆粒質量相關性研究*

黎桃敏，余欣彤，陳偉媚，徐東婷，胡 懿，施文婷，黃 瑤

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244）

陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，性苦、辛，味溫，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效[1]。藥材可分陳皮和廣陳皮，主產于廣東、浙江、江西、湖南、福建、四川、重慶等地[2]。陳皮以“橘柚”之名首載于《神農本草經》，被列為上品，且在眾多醫藥類古籍中都有記載，具有良好的藥用價值[3]。現代研究表明，陳皮活性成分主要為黃酮類化合物，包括蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素等[2]，此外還含揮發油類、生物堿類和檸檬苦素等多種成分[3-5]。其主要藥理作用包括降血脂、調節胃腸平滑肌運動、化痰、抗腫瘤、抗氧化、抗炎和保肝等[6-8]，體現了中藥的物質基礎是由多分子、多成分組成的復雜整體[9]。

中藥飲片是中藥臨床用藥的主要形式，而中藥配方顆粒是依據中醫藥理論和患者需求，由單味中藥飲片經水提、濃縮、干燥、制粒而成，是對中藥飲片的補充[10]。陳皮飲片經加工制成配方顆粒后，已不具飲片外形，僅依據2020年版《中華人民共和國藥典》對其指標成分進行含量測定難以實現整體質量評價。相較于傳統的經驗鑒別和單組分分析，中藥指紋圖譜可以整體、宏觀地表征被測樣品主要化學成分的特征，實現對中藥內在質量的綜合評價[11-12]。為了全面客觀地評價陳皮傳統飲片與配方顆粒之間的關聯性，本研究采用UPLC法分別測定了陳皮飲片和配方顆粒的指紋圖譜，比較兩者之間的相關性和差異性，以期為陳皮相關制劑的研究提供實驗依據，更好地開展陳皮配方顆粒質量控制工作。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters H-CLASS型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q Direct型超純水系統（德國Merck公司）；B-290型噴霧干燥儀（瑞士BUCHI有限公司）；LGS20型干法制粒機（南京迦南科技有限公司）；YRE-501型旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DLSB-5/20型低溫冷卻液循環水泵（鄭州長城科工貿有限公司）；111B型二兩裝高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）；TC-15型套式恒溫器（海寧市新華醫療器械廠）；HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 蕓香柚皮苷對照品（批號：wkq19041908，純度98.0%）、川陳皮素對照品（批號：wkq20031701，純度98.0%）均購自四川省維克奇生物科技有限公司；橙皮苷對照品（批號：110721-202019，純度95.3%）購自中國食品藥品檢定研究院；橘皮素對照品（批號：18031501，純度98.0%）購自成都普菲德生物技術有限公司；乙腈、冰醋酸、甲醇為色譜級（德國Merck公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

15批陳皮飲片（編號：S1～S15）經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，均為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco的干燥成熟果皮。根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》中“研究表征標準湯劑用湯劑的制備”項的指導原則[13]，確定陳皮配方顆粒的制備方法：取陳皮飲片，加水煎煮2次，第一次加入投料量8倍的水，浸泡30 min，加熱煎煮30 min，煎液用350目篩趁熱過濾；第二次加投料量6倍的水，加熱煎煮25 min，煎液用350目篩趁熱過濾，合并兩次濾液，得陳皮提取液。提取液低溫減壓濃縮至適量，濃縮液過250目篩網得陳皮清膏。清膏進行噴霧干燥，收集噴干粉，再加輔料適量，混勻，干法制粒，得陳皮配方顆粒。15批陳皮配方顆粒樣品（編號：E1～E15）分別由15批飲片對應制備，飲片產地、飲片及對應配方顆粒編號見表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結果

2.1 色譜條件[14]色譜柱：Acclaim RSLC 120 C18Column（100 mm×2.1 mm，2.2 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%冰醋酸溶液（B）梯度洗脫（0～15 min，13%～20%A；15～25 min，20%～34%A；25～44 min，34%～42%A）；流速：0.40 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：283 nm；進樣量：1.0 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備 分別取蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素對照品適量，精密稱定，加入甲醇配制成每1mL含蕓香柚皮苷106.82 μg、橙皮苷115.50 μg、川陳皮素123.97 μg、橘皮素69.09 μg的混合對照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備 取陳皮飲片粉末（過二號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱定質量，超聲處理（功率：300 W，頻率：45 kHz）1 h，取出，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得飲片供試品溶液。

取陳皮配方顆粒適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率：240 W，頻率：45 kHz）1 h，取出，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得配方顆粒供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果顯示，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應的保留時間處具有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。（見圖1）

圖1 UPLC 色譜圖

2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，以2號峰橙皮苷為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。RSD范圍分別為0.15%～0.25%和0.15%～0.21%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取陳皮飲片S15，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，以2號峰橙皮苷為參照峰，計算得各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。RSD范圍分別為0.43%～1.34%和1.62%～2.76%，表明陳皮飲片供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取陳皮飲片S15，精密稱定，平行稱定6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以2號峰橙皮苷為參照峰，計算得各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。RSD范圍分別為0.06%～0.09%和1.96%～2.91%，表明該方法重復性良好。

2.5 UPLC指紋圖譜的確立與相似度評價

2.5.1 指紋圖譜的確立 取15批陳皮飲片及其配方顆粒，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，得15批陳皮飲片及其配方顆粒的UPLC指紋圖譜，將采集到的UPLC色譜圖導入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”軟件進行匹配，分別生成對照指紋圖譜R1和R2。15批陳皮飲片、配方顆粒指紋圖譜的堆疊圖見2～3。從15批陳皮飲片與配方顆粒的指紋圖譜中，共標記出5個共有峰，通過與對照品圖譜對比，確定1號峰為蕓香柚皮苷，2號峰為橙皮苷，4號峰為川陳皮素，5號峰為橘皮素。

圖2 15 批陳皮飲片的UPLC 指紋圖譜堆疊圖

圖3 15 批陳皮配方顆粒的UPLC 指紋圖譜堆疊圖

2.5.2 相似度評價 將15批陳皮飲片及其配方顆粒指紋圖譜的數據文件導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”軟件，分別計算各批次陳皮飲片、陳皮配方顆粒指紋圖譜與其對照圖譜的相似度，結果見表2。15批陳皮飲片指紋圖譜與其對照指紋圖譜（R1）的相似度均≥0.990，表明不同批次陳皮飲片的質量較為穩定。15批陳皮配方顆粒指紋圖譜與其對照指紋圖譜（R2）的相似度均≥0.910，表明不同批次陳皮配方顆粒的質量和生產工藝均較穩定。

表2 15 批陳皮飲片和配方顆粒UPLC 指紋圖譜與其對照指紋圖譜的相似度結果

2.5.3 對照指紋圖譜的比較 將15批陳皮飲片和陳皮配方顆粒指紋圖譜生成的對照指紋圖譜R1和R2導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”軟件，計算得陳皮飲片對照指紋圖譜R1與陳皮配方顆粒對照指紋圖譜R2的相似度為0.962。通過對陳皮飲片和陳皮配方顆粒的對照指紋圖譜的共有峰進行分析，可以看出陳皮飲片中主要色譜峰在陳皮配方顆粒的色譜圖中均有體現，而陳皮配方顆粒的主要色譜峰也能在飲片的圖譜中找到追溯，表明從陳皮飲片到陳皮配方顆粒成分無明顯變化，化學成分基本一致，二者具有一定的等效性，也反映出陳皮配方顆粒的制備工藝穩定可行。（見圖4）

圖4 陳皮飲片對照指紋圖譜（R1）與陳皮配方顆粒對照指紋圖譜（R2）

2.6 共有峰的相關性研究 分別計算15批陳皮飲片及其配方顆粒指紋圖譜共有峰的“峰面積/取樣量”值，結果見表3。不同批次陳皮飲片UPLC指紋圖譜中各共有峰的“峰面積/取樣量”值有所差異，也進一步影響著陳皮配方顆粒UPLC指紋圖譜中各共有峰的“峰面積/取樣量”值，為確保陳皮配方顆粒質量的穩定性，應嚴格把控陳皮飲片質量。采用SPSS 20.0軟件，以各特征峰的“峰面積/取樣量”值為變量，并為了消除各數據量綱和各數據之間相對大小差異對分析結果產生影響，對數據進行標準化預處理后進行Preason相關分析，結果見表4。結果表明陳皮飲片與配方顆粒UPLC指紋圖譜的5個共有峰中，除橙皮苷峰外，蕓香柚皮苷、峰3、川陳皮素和橘皮素均具有高度正相關性。

表3 15 批陳皮飲片與配方顆粒指紋圖譜共有峰的“峰面積/取樣量”值（mV·s·g-1）

續表3：

表4 15 批陳皮飲片與配方顆粒指紋圖譜共有峰的相關性研究結果

2.7 UPLC指紋圖譜的相關性研究

2.7.1 主成分分析 主成分分析法（PCA）是一種應用廣泛的多元統計方法，在不丟失原來主要信息的前提下，從多變量之間的相互關系對數據集進行降維，可快速實現對數據的可視化識別[15]。以各特征峰的“峰面積/取樣量”值為變量，通過SPSS 20.0軟件對其進行標準化預處理后進行因子分析，計算得特征值和方差貢獻率，見表5，主成分因子載荷矩陣見表6。以特征值＞1為提取標準提取主成分[16-17]，由表5～6可知，前兩個主成分累積貢獻率為97.042%＞90%，表明提取的2個主成分能基本反映全部指標的信息。主成分1的特征值為3.310，方差貢獻率為66.208%，載荷較高的峰有川陳皮素、橘皮素和蕓香柚皮苷，表明這3個峰主要反映主成分1的信息；主成分2的特征值為1.542，方差貢獻率為30.834%，載荷較高的峰有橙皮苷，表明這2個峰主要反映主成分2的信息。上述對陳皮指紋圖譜差異貢獻較大的成分，保留了原始變量的絕大部分信息，是影響陳皮飲片和配方顆粒質量的主要成分。

表5 特征值和方差貢獻率

表6 主成分因子載荷矩陣

2.7.2 綜合評分計算 采用SPSS 20.0 軟件將15批陳皮飲片和配方顆粒的“峰面積/取樣量”值進行標準化處理，得到Xi。由公式為特征值，由成分矩陣中的第j列載荷除以對應成分特征值的算術平方根所得），計算得到F1、F2，再根據綜合評分函數F=F1*0.662 1+F2*0.308 3（其中F1、F2為2個主成分的得分，系數為各成分的方差貢獻率），計算得到陳皮飲片及其配方顆粒指紋圖譜的綜合評分[18-19]，結果見表7。15批陳皮飲片及其配方顆粒UPLC指紋圖譜的綜合評分變化趨勢基本一致。

表7 15 批陳皮飲片和陳皮配方顆粒UPLC 指紋圖譜的綜合評分結果

2.7.3 相關性分析 以15批陳皮飲片及其配方顆粒UPLC指紋圖譜的綜合評分為變量，采用SPSS 20.0軟件對其進行Pearson相關分析。主成分綜合得分能夠一定程度上反映樣品質量[20]，從主成分綜合得分的Pearson相關分析結果可知，相關系數r值為0.980，P＜0.01。表明陳皮飲片及其配方顆粒之間存在高度正相關性，陳皮飲片與配方顆粒的質量密切相關。

3 討論

從共有峰相關性分析結果來看，陳皮飲片及其配方顆粒指紋圖譜中蕓香柚皮苷、橙皮苷、峰3、川陳皮素和橘皮素的相關系數分別為0.989、0.082、0.875、0.943、0.953，說明陳皮配方顆粒與陳皮飲片中蕓香柚皮苷、峰3、川陳皮素和橘皮素的含量相關性極強；陳皮配方顆粒與陳皮飲片中橙皮苷的含量無相關性，因陳皮配方顆粒制備過程中其提取溶媒為水，該結果可能與橙皮苷化合物的水溶性較差[21-22]有關。后期可對陳皮飲片、標準湯劑與配方顆粒的質量相關性進行研究，以更加全面、客觀地評價陳皮配方顆粒與標準湯劑物質基礎的一致性，并從源頭上做好質量控制工作。

影響中藥飲片質量的因素眾多，而中藥飲片的質量與中藥配方顆粒的質量緊密相關。本研究結果表明15批陳皮飲片及其配方顆粒UPLC指紋圖譜綜合評分的相關系數為0.980，陳皮飲片與配方顆粒對照指紋圖譜的相似度為0.962，說明陳皮飲片與配方顆粒的質量正相關性強，兩者的成分差異較小，為臨床上陳皮配方顆粒作為陳皮飲片的補充提供了依據，也為陳皮相關制劑的質量控制奠定了基礎。