通關藤提取物通過線粒體途徑誘導肝癌HepG2細胞凋亡研究*

黃爭榮，林 浩，林錦培，王 泳，何火聰，賴義勤

（福建省腫瘤醫院/福建醫科大學附屬腫瘤醫院，福建 福州 350014）

原發性肝癌（簡稱肝癌）是我國常見的惡性腫瘤之一，每年新發患者約占全球肝癌發病的55%[1]。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，且惡性程度高，病情發展迅速，確診時往往病情已進入晚期，而肝癌對放化療不敏感，因此晚期肝癌臨床治療效果總體不佳。

通關藤為蘿藦科牛奶菜屬植物，別稱通光藤、烏骨藤，始記載于《滇南本草》，味苦，性微甘、涼，具有清熱解毒、止咳平喘、祛痰等功效[2]。研究表明，通關藤提取物治療晚期原發性肝癌，具有較好的抗腫瘤療效，能改善患者生活質量[3-4]。通關藤抗腫瘤作用的具體機制尚不明確，因此本實驗以人肝癌細胞株HepG2為模型，探討通關藤提取物促進肝癌細胞凋亡的作用及其相關機制，為更好地開發利用通關藤提供實驗依據。

1 材 料

1.1 藥物與試劑MTE（南京圣和藥業有限公司，商品名：消癌平注射液，國藥準字Z20025868，生藥濃度為2.5 g/mL）；胰蛋白酶-EDTA（美國Hyclone公司，批號：J170049）；DMEM培養基（美國Hyclone公司，批號：NWM0534）；Annexin V-FITC/PI雙染法試劑盒（美國Becton Dickinson公司，批號KGA107）；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：C2006）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：23235）；ECL化學發光試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：32132）；一抗兔抗人Bcl-2、Bax、Cytochrome-c、Caspase-3、Caspase-9多克隆抗體及二抗辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IgG（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.2 主要儀器超凈工作臺（江蘇蘇州凈化設備公司）；3111型CO2培養箱（美國Thermo Electron公司）；Mikro高速離心機（德國Hettieh公司）；FACS Calibur流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）；Tetra凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；4000MM PRO凝膠成像分析系統（美國Carestream公司）。

2 方 法

2.1 細胞培養人肝癌HepG2細胞系由福建省腫瘤醫院放射生物學研究室傳代培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置37℃、5%CO2培養箱培養。取生長狀態良好、處于對數生長期HepG2細胞進行實驗。以不含MTE的DMEM培養基作為空白對照組，以不同濃度MTE處理的肝癌細胞為實驗組。

2.2 MTT法檢測細胞增殖情況將HepG2細胞按2×104個/孔接種于96孔培養板，培養24 h后待細胞貼壁，加入低、中、高劑量MTE（終濃度為15、20、30 mg/mL），同時設空白對照組（0 mg/mL）和調零組，每組3個復孔，置CO2培養箱中繼續培養24 h后，加入MTT溶液10 μL/孔，再置培養箱中培養4 h后，吸去上層清液。每孔加入100 μL DMSO，放置振蕩搖床上低速震蕩10 min，待產生的藍紫色結晶溶解后，用酶標儀在490 nm處測定各孔OD值。計算抑制率：抑制率=（1-藥物處理組OD值/空白對照組OD值）×100%。

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡將HepG2細胞按5×104個/孔接種于6孔板中，培養24 h后實驗組加入不同濃度MTE（終濃度分別為15、20、30 mg/mL）。作用24 h后，用胰酶消化收集細胞，并用預冷的PBS洗滌2次。根據Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明書方法，收集1×106細胞至離心管，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞。加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI室溫下避光反應15 min。使用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。

2.4 JC-1染色法檢測細胞線粒體膜電位細胞處理同“2.3”，作用24 h后取出細胞，用0.25%胰蛋白酶消化處理細胞，PBS沖洗2次，加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數次混勻，放置37℃孵育20 min后，加入JC-1 Buffer重懸細胞2次，離心沉淀細胞，加入適量PBS重懸沉淀，采用流式細胞儀檢測。綠色熒光通過FL1通道檢測，紅色熒光通過FL2通道檢測，以紅、綠熒光強度的相對比值來衡量線粒體膜電位去極化程度。

2.5 Western blotting檢測細胞相關蛋白表達將處于對數生長期的HepG2細胞按1×105個/孔接種于6孔板，24 h后加入不同濃度的MTE（終濃度分別為15、20、30 mg/mL）處理24 h。離心收集細胞，向各孔加入適量PMSF裂解液，收集上清液，用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。將定量的蛋白經10%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，120 V恒壓1 h轉移至NC膜，3%BSA于4℃封閉過夜，TTBS（Tris-HCl 20 mmol/L，pH 7.2，NaCl 150 mmol/L，吐溫-20 0.1%）洗膜，分別加入Bcl-2、Bax、Cytochrome-c、Caspase-3、Caspase-9一抗與膜上抗原結合，用相應HRP標記的二抗與其反應后加ECL化學發光試劑，多功能成像分析系統采集數據并分析。以目的蛋白與內參照β-actin蛋白電泳條帶的吸光度比值表示蛋白的相對表達量。

2.6 統計學方法應用SPSS 24.0軟件進行數據統計分析，每組實驗平行重復3次。計量資料采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 MTE對HepG2細胞增殖的影響MTT實驗結果顯示，經不同濃度藥物處理HepG2細胞24 h后，低、中、高濃度MTE對HepG2細胞增殖均表現明顯抑制作用，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），抑制率隨藥物濃度的增加而增加，呈劑量依賴效應關系。（見表1）

表1 各組HepG2細胞增殖比較（±s，n=3）

表1 各組HepG2細胞增殖比較（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，aP＜0.01

組別 給藥濃度（mg/mL） 抑制率（%）空白對照組 0 0 MTE低劑量組 15 17.36±2.47a MTE中劑量組 20 41.92±2.64a MTE高劑量組 30 56.81±3.11a

3.2 MTE對HepG2細胞凋亡的影響隨著MTE濃度的增加，HepG2細胞24 h后的凋亡率明顯升高，并且凋亡程度呈濃度依賴性，各實驗組與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。（見圖1、表2）

圖1 各組HepG2細胞凋亡情況

表2 各組HepG2細胞凋亡率比較（±s，n=3）

表2 各組HepG2細胞凋亡率比較（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，aP＜0.01

組別 給藥濃度（mg/mL） 凋亡率（%）空白對照組 0 5.92±0.23 MTE低劑量組 15 7.97±0.16a MTE中劑量組 20 8.42±0.20a MTE高劑量組 30 16.26±0.74a

3.3 MTE對HepG2細胞線粒體膜電位的影響空白對照組HepG2細胞線粒體膜電位（FL-2/FL-1）為4.33±0.18，MTE低、中、高劑量組HepG2細胞線粒體膜電位分別下降至2.86±0.12、1.25±0.08、0.81±0.07，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。（見圖2）

圖2 各組HepG2細胞線粒體膜電位比較（±s，n=3）

3.4 MTE對HepG2細胞相關蛋白的影響MTE低劑量組Bax表達與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），MTE中、高劑量組可以上調Bax、Cytochrome-c、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達（P＜0.01或P＜0.05）。MTE各劑量組均可以下調Bcl-2蛋白的表達，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。（見圖3、表3）

圖3 各組HepG2細胞凋亡相關蛋白電泳條帶

表3 各組HepG2細胞凋亡相關蛋白相對表達量比較（±s，n=3）

表3 各組HepG2細胞凋亡相關蛋白相對表達量比較（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別 給藥濃度(mg/mL)Bcl-2 Bax Cytochrome-c Caspase-9 Caspase-3空白對照組 0 0.522±0.026 0.133±0.007 0.284±0.043 0.125±0.011 0.154±0.006 MTE低劑量組15 0.371±0.031b 0.154±0.006 0.448±0.040b 0.164±0.012a 0.281±0.015b MTE中劑量組20 0.326±0.022b 0.347±0.027b 0.657±0.049b 0.255±0.013b 0.426±0.017b MTE高劑量組30 0.248±0.023b 0.464±0.035b 0.761±0.042b 0.685±0.031b 0.482±0.011b

4 討 論

目前治療晚期肝癌有效藥物較少，中藥因具有多靶點、多環節、副作用低等特點，在治療肝癌方面具有很大的優勢，從中藥中尋找新型安全有效的抗肝癌藥物已經成為研究熱點[5]。通關藤具有廣泛的藥理活性，包括平喘、降壓、免疫調節、保肝利尿等[6]。近年來，越來越多研究表明通關藤具有較強的抗肝癌活性[7-9]，臨床上治療肝癌也獲得較好的療效[10-11]，但探討其具體作用機制的研究仍較少。

細胞凋亡又稱程序性死亡，是細胞為維持內環境穩定，由細胞自身基因調控的細胞死亡形式[12]。腫瘤的發生不僅是分裂失控導致的細胞過度增生，同時也是細胞凋亡通路受阻，使本該死亡的細胞繼續存在而產生腫瘤。在各種致癌因素作用下，基因發生突變，影響細胞增殖與死亡機制，導致細胞增殖過度，凋亡減弱，細胞數量無限增多，在病變部位堆積而形成腫瘤。細胞凋亡機制障礙既是腫瘤發生的重要早期事件，也是伴隨其全程的重要病理現象[13]。目前抗腫瘤的一項重要干預策略是通過誘發腫瘤細胞凋亡，使腫瘤自然消亡。本實驗結果提示，MTE處理HepG2細胞24 h后，HepG2細胞增殖明顯下降，各劑量組細胞凋亡率均明顯高于空白對照組，表明MTE具有誘導HepG2細胞凋亡的作用，并隨著藥物濃度增加，細胞凋亡率相應增加，具有一定的劑量依賴性。

目前研究認為細胞凋亡的主要途徑有兩條：外源性死亡受體途徑和內源性線粒體凋亡途徑。Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的主要調控因子[14]，包括Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡因子和Bax、Bak等促凋亡因子。在致凋亡因子的刺激下，Bcl-2維持線粒體膜完整性的作用下降，Bax易位至線粒體膜外，引起線粒體膜通透性發生改變，繼而線粒體跨膜電位降低而去極化，線粒體基質中釋放出Cytochrome-c等活性因子，Cytochrome-c進入胞質在ATP/dATP的協同作用下與凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）結合形成寡聚體，激活Caspase-9，進而活化下游Caspase-3等酶系。激活的Caspase-3可以水解包括細胞調節、細胞信號轉導、DNA修復等環節中重要的蛋白，從而導致細胞凋亡[15-16]。由此可見，在線粒體凋亡途徑中，線粒體膜電位下降是細胞凋亡級聯反應過程中早期發生的重要環節[17]，Caspases家族在細胞凋亡的信號通路中具有中心主導作用[18]，其中Caspase-3更是起著關鍵的功能[19]，一旦Caspase-3被激活，不可避免誘發細胞凋亡。本研究結果顯示，經MTE處理24 h后，HepG2細胞Bcl-2表達顯著下降，Bax表達顯著升高，線粒體膜電位下降，Cytochrome-c、Caspase-9、Caspase-3的表達顯著上調，提示MTE能夠啟動內源性線粒體凋亡途徑相關級聯反應，誘導腫瘤細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤作用。