甾體化合物的微生物轉化研究進展

李偉 解寶玥 王俊偉

山東新華制藥股份有限公司 山東淄博 255000

甾體化合物在自然界中有著廣泛存在，微生物轉化是指微生物細胞把復雜的外源物質做特定結構裝飾這一過程，也就是將微生物作為載體，經由菌體于代謝過程當中所產生的酶來催化外源性底物發生反應。甾體類化合物的微生物轉化無論是對新一代的甾體藥物、還是關鍵中間體的合成，皆不失為是有力工具。

1 甾體類化合物的微生物轉化工藝

甾體微生物轉化工藝主要有以下兩個階段：①菌體生長：在此階段，目的是為菌體提供充足營養，為菌體的生長提供有利的生長條件；為了進一步提高甾體化合物的轉化成功率，也要予以菌體充足的生長繁殖時間，在確保其合適菌體濃度之后，加入底物轉化；通常細菌需要12-24h 的培養時間、真菌需要24-72h 的培養時間。②底物轉化：在歷經了前期菌體大量生長繁殖之后，菌體產酶催化底物轉化成產物。

但是在底物轉化的這一過程當中，需考慮到底物是存在疏水性的，所以添加底物時要輔助一些助溶舉措。例如先在乙醇和甲醇等有機溶劑當中溶解底物，再將其加入發酵培養基當中。

但是這樣的方式卻存在一定的轉化缺陷，如底物常會于培養基中析出；加入底物的有機溶劑會產生對菌體的毒性作用，抑制菌體生長；底物濃度過高也會帶給菌體毒性作用。因此，研究學者也對如何提高甾體類化合物溶解度的新技術展開了研究。

2 甾體化合物微生物轉化率提高的方法

2.1 固定化細胞轉化技術的應用

固定化細胞用于甾體化合物微生物轉化過程，能夠針對有毒溶劑來保護反應環境。同時，固定化技術能夠保證微生物催化劑得到循環性利用。但是該方法的缺點表現在：存在固定化系統傳質的限制、生產率較低。

2.2 新型溶劑的應用

以選擇生物相容性非水溶劑為前提，培養基的設計無疑是研究的新方向。如對綠色溶劑的研究，像是超臨界流體：離子液體與天然油，再比如其它的液態聚合物，也都可以作為有機溶劑的替代品。有相關研究指出，在硅B 油培養基當中，Mycobacteriumsp.NRRL3805B 可以高效轉化植物甾醇為AD[1]。

2.3 濁點體系的應用

在有關研究中，提出對濁點系統于甾體微生物轉化過程中的效能，指出濁點系統不僅可以影響發酵上游過程，而且還能有效分離產物[2]。

2.4 環化糊精的應用

環糊精的各種作用、特別是改性環糊精，在甾醇微生物轉化過程中已經得到廣泛應用。它的應用能夠有效增加類固醇的溶解度，并刺激細胞的生長，促進細胞膜通透性。

2.5 優化菌株改良與發酵工藝

（1）進行優良菌種的培育。在工業微生物的發展過程當中，對具備轉化能力的菌株進行篩選及改良有積極意義。雖然說在自然環境當中所得到的轉化菌株有一定的轉化能力，但是原始菌株的不同、其轉化能力也是有差異性的，所以得到轉化率高或是可以作為工業化生產的原始菌株有限。繼而，想要進一步提高菌株轉化甾醇的能力，有必要采取微生物工業育種手段，目的是對原始菌株進行改良，從而得到高產菌株。

①物理誘變。包括紫外誘變、離子束、激光、超聲波等物理誘變育種方法，其中紫外誘變廣為使用。具體而言是借助于胸腺嘧啶二聚體來將基因復制打亂，從而使得堿基序列錯亂發生突變。該方法的應用優勢在于所需設備簡單、操作安全便捷，誘發率高。

②化學誘變。化學誘變方法指的是經化學誘變劑和DNA 分子作用來對DNA 分子結構進行改變，具體根據不同的作用方式可分成：烷化類、移碼突變劑、堿基類似物三類。

③基因重組。重組DNA 技術的發展，給構建基因工程提供了良好的支持條件。如實驗報道中[3]，通過重組細胞色素P450 在大腸桿菌中的表達，實驗得到可將孕酮轉化為3β-羥基-5-雄甾-17-酮的突變菌株。

④復合誘變。基于誘變方法的多種多樣，僅采用一種誘變手段于生物誘變過程中的應用已不能再滿足工業育種需求，因此，近年來人們也將研究的焦點放在使用兩種或兩種以上誘變方法上。

（2）優化發酵工藝。微生物生長離不開豐富的營養支持，良好的pH 值、溫度條件以及溶氧條件均有利于促進菌體的正常生長，并利于促進發生酶促反應。菌體生長時，保證良好的基礎條件能夠為微生物生長與繁殖提供有力保障，繼而縮短大量菌體繁殖以及產生相應酶的時間。菌體進入底物轉化時，需要做好對各種轉化反應條件的控制，例如溫度控制、攪拌速度、合適的通氣量等。轉化時維護菌體良好生長是獲得較多酶的根本途徑。因微生物產酶條件與生長條件有一定差異性，因此對影響轉化的物理條件（通氣、挽拌等）、培養基的組成（微量元素、碳源等）非常必要。

3 討論

甾體化合物在細胞當中有著重要的生物功能，同時也表現出有多樣活性，近年以來，微生物系統在甾體生產中的應用有了更多的認知。但目前，利用微生物轉化篩選得到的甾體藥物或中間體種類還是不多，還有很多存在轉化甾體藥物的菌株尚未被發現。因此，對篩選有轉化甾體能力的菌株進行研究、得到有價值的轉化產物具有極大的現實價值。