夏秋茶大曲與傳統中溫大曲中微生物群落及多樣性研究

張 杰，程 偉，李 娜，潘天全，陳興杰，楊金玉，杜先鋒

（1.安徽金種子酒業股份有限公司，安徽阜陽236048； 2.安徽農業大學，安徽合肥238009）

中國白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，根據風味不同，白酒主要分為十二大類：濃香型、清香型和醬香型等[1-2]。其中濃香型白酒占白酒總量的70%，它是以高粱等谷物為原料，以酒曲為糖化發酵劑，經蒸煮、發酵、蒸餾等工藝制作而成[3]。在傳統固態白酒的釀造過程中，微生物群落的多樣性對白酒不同風格、產量及品質起到關鍵性作用[4]。大曲是一種富含釀酒所需要的菌系、酶系、物系的復合載體，具有“糖化、發酵、生香”等功能，是傳統固態釀酒發酵的動力[5]。大曲中含有以霉菌和酵母菌為主的真菌以及較小的細菌，這些微生物菌落便是酒體風味品質形成的關鍵因素[6]。因此探究濃香型大曲培養過程中微生物群落組成和功能有助于解析大曲的風味信息，在大曲培養過程中調整培養條件，對提高大曲及濃香型白酒質量有深遠意義[7]。

傳統大曲微生物研究主要以各種微生物類型培養皿篩選，通過微生物群落形狀特征、理化特征及菌落數目進行相關研究。大曲的研究多趨向于單一的風味或者微生物[8]，近年來隨著生物化學和分子生物技術的不斷發展，研究者可以借助高通量測序技術，進一步分析大曲中微生物群落的多樣性[9]。茶是世界上公認的健康飲料，夏秋茶在夏秋季節光照強、溫度高的條件下生長速率快，導致其持嫩性差，茶葉易老化，其碳代謝程度較高，氮代謝程度相對較低，從而使得茶葉中多酚類物質較高，而芳香物質、維生素、氨基酸等含量低，質量明顯低于春茶[10-11]。在大曲制作過程中，夏秋茶經粉碎后與曲料混合制成茶曲，多酚含量高的夏秋茶對曲塊中的微生物具有選擇性的影響，并產生特征性的生物化學反應，導致曲塊微生物種類、生物酶類有顯著特點[12]。

本研究通過高通量測序技術，分別對同一時間入房培養的傳統中溫大曲、茶曲以及它們在培養階段的微生物群落結構多樣性變化進行研究，得出兩種大曲主要微生物群落構成，結合培養階段環境條件記錄，根據所需大曲要求更好地調控大曲培養條件，以期為白酒提質、增加健康因子提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

大曲取樣：對安徽金種子生態釀酒基地培曲車間同一天入房傳統中溫大曲（以下簡稱中溫大曲）、夏秋茶大曲茶曲（以下簡稱茶曲）進行取樣，兩種大曲培養時間均為27 d，分別取入房第1天、第3天、第5天、第7天、第12天、第17天、第22天、第27天曲樣，所對應的樣品名稱分別為CHU1、CHU2、CHU3、CHU4、CHU5、CHU6、CHU7、CHU8（中溫大曲），CHA1、CHA2、CHA3、CHA4、CHA5、CHA6、CHA7、CHA8（茶曲）。每次取樣從固定的3個點（內、中、外）周邊取并暫存于無菌塑封袋，帶回微生物實驗室并在無菌環境中進行粉碎，采用四分濃縮法留樣保存于無菌袋中，存于-80℃冰箱中備用。

儀器設備：SW-CJ-2D型超凈工作臺，深圳市瑞鑫達化玻儀器有限公司；小型多功能粉碎機，永康市久品工貿有限公司；醫用低溫保存箱，安徽中科都菱商用電器股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲微生物DNA提取及PCR擴增定量

采用CTAB或SDS方法對樣本的基因組DNA進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。

以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物(Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer:New England Biolabs)和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。

引物對應區域：16S V4區引物（515F和806R）：鑒定細菌多樣性。

ITS1區引物（ITS5-1737F和ITS2-2043R）：鑒定真菌多樣性。

1.2.2 PCR產物的混樣和純化

PCR產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；對檢測合格的PCR產物進行磁珠純化，采用酶標定量，根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物。

1.2.3 文庫構建和上機測試

使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用Nova-Seq6000進行上機測序。

2 結果與分析

2.1 中溫大曲、茶曲微生物聚類

2.1.1 花瓣圖分析

根據聚類得到OTUs結果，分析不同樣本之間共有、特有的OTUs，當樣本數大于5時，繪制成花瓣圖如圖1。中溫大曲在8個時間點所取樣品共獲得細菌OTU數目為220個，其中共有的細菌OTU為98個，茶曲共獲得細菌OTU數目為303個，其中共有的細菌OTU為92個；中溫大曲在8個時間點所取樣品共獲得真菌OTU數目為345個，其中共有的真菌OTU為32個，茶曲共獲得真菌OTU數目為310個，其中共有的真菌OTU為23個。

圖1 OTU分布花瓣圖

2.1.2 物種分布情況分析

根據分類學分析結果，可以得知不同組樣品在各類水平（界、門、綱、目、科、屬、種）上的群落結構組成情況。根據群落柱形圖，可以直觀呈現兩方面信息：(1)各樣本在某一分類學水平上主要包括的微生物；(2)樣本中各微生物的相對豐度（所占比重）[13]。如圖2、圖3分別為中溫大曲、茶曲中細菌及真菌在屬水平上各物種的豐度組成結構。

圖2 中溫大曲、茶曲在屬水平上細菌物種豐度組成

圖3 中溫大曲、茶曲在屬水平上真菌物種豐度組成

本研究中，利用高通量測序方法從中溫大曲、茶曲中共檢測出266個菌屬。從圖2可以看出，從曲塊入房剛開始就網羅了環境中的微生物資源，隨著曲塊培育時間的增加，曲塊中微生物菌屬也發生著一些變化。主要細菌屬有Lactobacillus（乳桿菌屬）、Pseudomonas（假單孢菌屬）、Acetobacter（醋菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）、Pantoea（泛菌屬）、Kocuria（考克氏菌屬）、Leuconostoc（明串珠菌屬）、Brevibacterium（短桿菌屬），其中Kocuria（考克氏菌屬）在茶曲中屬于主要菌屬但在中溫大曲中非主要菌屬。在整個培曲過程中，Lactobacillus屬于優勢菌種，其含量一直大于10%；Pseudomonas在剛入房前2天屬于優勢菌種，且僅處于中溫大曲時含量高于10%，但后期含量下降明顯；Acetobacter隨著曲塊培養時間增加呈現出先增加后降低的趨勢，中期8～10 d時含量最高，但在中溫大曲中不屬于優勢菌種，在茶曲中含量大于10%屬于優勢菌種。由此可見，原料使用不同對大曲中細菌多樣性存在影響，在不同的培曲時間下大曲中的優勢菌種發生變化，但乳桿菌屬一直屬于優勢菌屬。陳申習等[14]采用傳統分離方法和現代分子技術對清香型小曲白酒機械化生產中微生物動態變化進行了研究，發現酒醅微生物的細菌主要為乳桿菌屬和芽孢桿菌屬。

從圖3可以看出，中溫大曲、茶曲從入房到培養結束有8個真菌屬相對豐度大于1%，分別為Blumeria（布氏白粉菌屬）、Saccharomycopsis（扣囊復膜孢酵母屬）、Rhizopus（根霉菌屬）、Thermoascus（熱子囊菌屬）、Issatchenkia（伊薩酵母屬）、Wickerhamomyces（異常威克漢姆酵母）、Aspergillus（曲霉菌屬）、Hanseniaspora（西方有孢漢遜酵母），其中Blumeria、Saccharomycopsis、Rhizopus、Thermoascus、Issatchenkia、Wickerhamomyces相對豐度均大于10%，屬于培曲過程中的優勢菌種。研究表明，Blumeria在中溫大曲及茶曲培養前期0～8 d含量最高，但隨后下降明顯且最終含量低于1%；Saccharomycopsis、Wickerhamomyces在中溫大曲及茶曲培養階段呈現出先上升后下降的趨勢；Issatchenkia在中溫大曲及茶曲中初始含量均為零，在中期6～8 d時含量增加到10%以上，但后期含量明顯降低且低于1%；Rhizopus、Thermoascus在中溫大曲及茶曲培養過程中呈現出逐漸增加的趨勢，且最終成為主導菌種。值得一提的是，Saccharomycopsis在中溫大曲中最終含量為12.12%，茶曲中最終含量為25.31%，差異明顯。由此可見，大曲中茶葉的添加對真菌優勢菌種的分布有一定的影響，在不同的培曲時間下中溫大曲及茶曲中的優勢菌種變化明顯。雷振河[15]應用高通量測序技術對清香型白酒釀造用大曲和酒醅中微生物構成進行了分析，發現大曲中優勢真核微生物主要包括曲霉菌屬、熱子囊菌屬、根霉菌屬、嗜熱真菌屬、假絲酵母屬，其中本研究中曲霉菌屬、熱子囊菌屬、根霉菌屬與其結果相似，存在差異可能是環境、原料、工藝等因素造成的[16]。

2.2 Alpha多樣性分析

2.2.1 微生物多樣性指數分析

使用Illumian MiSeq高通量測序技術分別對8個中溫大曲、8個茶曲樣品中微生物多樣性進行分析，其細菌16S rRNA測序結果及多樣性見表1，真菌ITS測序結果及多樣性見表2。Observed_species：直觀觀測到的物種數目（也即是OTUs數目）。Shannon：樣品中的分類總數及其占比。群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數越大。Simpson：表征群落內物種分布的多樣性和均勻度。Chao1：估計群落樣品中包含的物種總數。ACE：估計群落中OTU數目。Goods_coverage：測序深度指數。PD_whole_tree：群落內物種的親緣關系。

如表1所示，中溫大曲中CHU7細菌豐富度最高，茶曲中CHA8細菌豐富度最高，中溫大曲中CHU8細菌多樣性最高，茶曲中CHA7細菌多樣性最高。如表2所示，中溫大曲中CHU6真菌豐富度最高，茶曲中CHA1真菌豐富度最高，中溫大曲中CHU3真菌多樣性最高，茶曲中CHA4真菌多樣性最高。

表1 中溫大曲、茶曲細菌多樣性指數

表2 中溫大曲、茶曲真菌多樣性指數

2.2.2 稀疏曲線和等級聚類曲線分析

稀釋曲線是從樣本中隨機抽取一定測序量的數據，統計它們所代表物種數目（即OTUs數目），以抽取的測序數據量與對應的物種數來構建曲線。稀釋曲線可直接反映測序數據量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度，當曲線趨向平坦時，說明測序數據量漸進合理，更多的數據量只會產生少量新的物種（OTUs）。如圖4所示，中溫大曲、茶曲的細菌和真菌稀釋曲線都隨測序深度的增加呈現先增加后平緩的趨勢，這表明細菌、真菌的測序量合理，能夠反映出樣品中的微生物信息。

圖4 細菌、真菌稀釋曲線分析圖

等級聚類曲線是將樣本中的OTUs按相對豐度（或者包含的序列數目）由大到小排序得到對應的排序編號，再以OTUs的排序編號為橫坐標，OTUs中的相對豐度（也可用該等級OTU中序列數的相對百分含量）為縱坐標，將這些點用折線連接，即繪制得到Rank Abundance曲線，它可直觀的反映樣本中物種的豐富度和均勻度。在水平方向上，物種的豐富度由曲線的寬度來反映，物種的豐富度越高，曲線在橫軸上的跨度越大；在垂直方向上，曲線的平滑程度，反映了樣本中物種的均勻程度，曲線越平緩，物種分布越均勻[17]。如圖5所示，各樣品細菌、真菌等級聚類曲線均趨向平緩，說明各樣品細菌、真菌的測序數據物種組成的均勻度高，細菌微生物多樣性豐度及均勻度高于真菌。

圖5 細菌、真菌等級聚類曲線分析圖

2.3 Beta多樣性

2.3.1 NMDS分析

無度量多維標定法（NMDS,Non-Metric Multi-Dimensional Scaling）[18]統計是一種適用于生態學研究的排序方法。NMDS是基于Bray-Curtis距離來進行分析的非線性模型，根據樣本中包含的物種信息，以點的形式反映在二維平面上，克服了線性模型（包括PCA、PCoA）的缺點，更好地反映生態學數據的非線性結構[19]。應用NMDS分析，根據樣本中包含的物種信息，以點的形式反映在多維空間上，而對不同樣本間的差異程度，則是通過點與點間的距離體現，能夠反映樣本的組間和組內差異等。

在NMDS分析中stress值大小體現了分析結果的優劣性，如圖6所示stress值＜0.001，NMDS分析圖可被認為一個好結果的差異性排序。其中CHU1、CHU2、CHU3、CHU4、CHU5 聚 為 一 類 ，CHA1、CHA2、CHA3、CHA4、CHA5聚為一類，可以看出中溫大曲與茶曲在培養前期細菌多樣性區別明顯，這與細菌前中期多樣性分布分析結果相似，說明在大曲中添加茶葉對曲塊培養前中期的細菌多樣性影響明顯，可能是前中期茶葉的添加影響了曲塊水分含量、水分散失速度、pH值等，使茶曲升溫較慢，因此對細菌微生物菌落差異影響較大。CHU6、CHU7、CHU8、CHA7、CHA8聚為一類，可以看出傳統大曲與茶曲在培養后期細菌多樣性區別較小，曲塊各項理化指標也基本相同，對細菌的生長代謝影響小，因此后期中溫大曲與茶曲細菌生態結構之間不存在明顯差異。CHA6單獨聚為一類，推測可能與翻曲過程中工藝操作差異性有關，需進一步研究分析。

圖6 中溫大曲、茶曲細菌生態結構中屬水平上的NMDS分析

如圖7所示，在屬類水平上stress值為0.149，而當stress＜0.2時，可用NMDS二維點圖表示，其圖形更能說明分析數據所體現出的意義。其中CHU1、CHU2、CHU3、CHU4 聚為一類，CHA1、CHA2、HCA3、HCA4、CHA5 聚為一類 ，CHU5、CHU6、CHU7 聚為一類，CHA6、CHA7、CHA8、CHU8聚為一類，可以看出中溫大曲、茶曲在培養過程中真菌差異性明顯，說明原料不同對曲塊前中期真菌微生物多樣性影響較大，可能是茶葉的添加影響了曲塊中水分含量、曲塊透氣性、pH值等理化因素，從而使曲塊在培養前中期升溫差異較大，因而影響曲塊中真菌微生物多樣性。其中CHU8與茶曲聚為一類，推測可能與環境因素有關，需進一步研究分析。

圖7 中溫大曲、茶曲真菌生態結構中屬水平上的NMDS分析

2.3.2 聚類樹分析

對中溫大曲、茶曲樣品中微生物OTUs信息進行加權聚類分析[20-21]，結果見圖8、圖9。由圖8可知，中溫大曲及茶曲中細菌優質序列中可以歸類為9個門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、類桿菌門（Bacteroidota）、藍藻門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、脫硫菌門（Desulfobacterota）、彎曲桿菌門（Campilobacterota）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）。其中厚壁菌門、變形菌門、類桿菌門和放線菌門占比較大，分別為40.44%、20.94%、14.50%、12.13%，另外，4種菌門中，中溫大曲中的厚壁菌門占比較多，茶曲中變形菌門、類桿菌門和放線菌占比較多。厚壁菌門為大曲中的優勢微生物，可能是優勢細菌屬屬于該門，且厚壁菌門主要由芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia）等微生物組成[22]，具有很強的環境適應性，能夠在相對極端的條件下保持生長代謝；放線菌廣泛分布于土壤環境、海洋環境、植物體及其他極端自然生態環境中，與厚壁菌門相似，也具有極強的耐受性[23]。

圖8 中溫大曲、茶曲細菌生態結構中門水平上的聚類樹分析

由圖9可知，中溫大曲及茶曲中真菌優質序列中可以歸類為10個門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、無孢子菌門（Aphelidiomycota）、捕蟲霉門（Zoopagomycota）。其中子囊菌門、毛霉門、擔子菌門占比比較大，分別為66.44%、5.19%、4.19%，3種菌門中，中溫大曲中擔子菌門占比較多，茶曲中子囊菌門、毛霉門占比豐富。子囊菌門是曲皮和曲心中的唯一優勢菌門，也是中溫大曲中的優勢真菌菌門。

圖9 中溫大曲、茶曲真菌生態結構中門水平上的聚類樹分析

3 結論

大曲是白酒釀造過程中微生物的主要來源，大曲微生物的群落結構的組成往往影響著白酒的品質。本研究利用高通量測序技術，分別對同一時間入房培養的中溫大曲、茶曲以及它們在培養階段的微生物群落結構多樣性變化進行研究，得出兩種大曲主要微生物群落構成。結果表明：（1）中溫大曲細菌OTU數目為220個，茶曲細菌OTU數目為303個；中溫大曲真菌OTU數目為345個，茶曲真菌OTU數目為310個，中溫大曲中真菌OTU數目占優勢，茶曲中細菌OTU數目占優勢；（2）大曲中優勢細菌菌屬分別為乳桿菌屬、假單孢菌屬、醋菌屬、葡萄球菌屬、泛菌屬、考克氏菌屬、明串珠菌屬、短桿菌屬，其中考克氏菌屬僅在茶曲中屬于主要菌屬；大曲中優勢真菌菌屬分別為布氏白粉菌屬、扣囊復膜孢酵母屬、根霉菌屬、熱子囊菌屬、伊薩酵母屬、異常威克漢姆酵母、曲霉菌屬、西方有孢漢遜酵母，各菌屬在中溫大曲、茶曲中含量差異較大；由此可見，原料中添加茶葉對曲塊細菌、真菌多樣性影響明顯；（3）在培曲過程中，隨著培育時間的增加，中溫大曲與茶曲中的乳桿菌屬（Lactobacillus）在整個培曲過程中都屬于優勢菌屬，而其他菌屬受環境因素影響明顯；（4）NMDS多樣性分析結果表明，曲塊中添加茶葉對細菌前期多樣性影響明顯，但對后期多樣性影響較小，對于真菌而言，前后期多樣性影響均明顯。

從曲塊原料配制到曲塊入房培養的過程都是微生物選擇、富集的過程，因此對大曲微生物群落的構成，不同原料對大曲微生物多樣性影響，培養過程中微生物多樣性變化等研究，將有助于從生物學角度為制曲工藝的調整、優化提供科學依據。