乳酸菌發酵改良枸杞酒風味工藝研究

陳彥輝，董建方，朱銀龍，周學義，馮天霞，張建波，劉 樂

（寧夏紅枸杞產業有限公司，寧夏中寧755100）

枸杞（Lycium barbarumL.）是一種多年生茄科灌木植物，其果實枸杞子長1～2 cm，呈鮮橙紅色橢圓形[1-3]。作為一味傳統的滋補中藥，枸杞具有極高的藥用、食用和經濟價值。枸杞子中富含枸杞多糖、類胡蘿卜素、多酚等活性成分，具有抗氧化、提高免疫力等優良的生物活性[4-5]。乳酸菌是一類利用碳水化合物發酵且主要產物為乳酸的革蘭氏陽性菌的統稱[6]。發酵過程中除了產生大量乳酸外，還伴隨有酯類等風味物質的產生，可以充分提升產品風味、香氣感官特征、抗氧化能力，在食品行業有廣泛的應用[7-9]。發酵型枸杞酒是以枸杞為原料發酵而成的低度飲料酒，果香濃郁、口感馥郁，兼具較好的營養價值。大部分果酒的釀造工藝主要是在葡萄酒的釀造工藝基礎上，根據自身原料的特性進行改良，枸杞酒也不例外。葡萄酒的發酵主要分為2個階段，即前發酵和后發酵，前發酵主要是酒精發酵，糖分在酵母的作用下轉化為酒精和二氧化碳，后發酵則主要是進行蘋果酸-乳酸發酵，蘋果酸在明珠串菌的作用下轉化為乳酸[10-11]。通過蘋-乳發酵可避免蘋果酸帶來的粗糙酸澀感，使口感變得柔軟順滑，同時可以提高酒體的生物穩定性以及增加酒體風味復雜性[12]。枸杞酒受限于原料本身特性，在釀造過程中不具備觸發蘋乳發酵的條件，這可能與枸杞發酵酒酒體略顯單薄，酒體風味物質不夠豐富存在一定的關聯，從而影響消費者的飲用感官和枸杞酒的市場銷量。

文獻檢索表明，目前針對枸杞酒風味物質提升的研究熱點主要集中于釀酒酵母、非釀酒酵母的篩選，未見采用乳酸菌發酵提升枸杞酒體風味物質的報道。這主要是因為乳酸菌發酵過程中，產生大量風味物質的同時，伴隨有大量乳酸的產生。如何在不破壞酒體風味的前提下中止乳酸發酵以及如何解決大量乳酸帶來的酸感突出破壞酒體協調性的問題，是制約乳酸菌發酵應用于果酒釀造的主要因素。本工藝采用乳酸菌發酵，提升酒體風味物質含量，改良枸杞酒品質。采用陶瓷膜過濾分離出乳酸菌，中止乳酸發酵過程。分離出的乳酸菌截留液，經真空冷凍干燥、調配后制作為高附加值產品——益生菌粉。通過控制乳酸發酵程度、水稀釋、甘油調配來平衡乳酸過量導致的酸感突出問題。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：枸杞鮮果，寧夏紅枸杞產業有限公司石喇叭種植基地。

菌株：乳酸菌VEGE092，杜邦丹尼斯克（中國）有限公司；AC酵母，天津盛豐商貿有限公司。

試劑及耗材：D-異抗壞血酸鈉，江西百勤異VC鈉有限公司；低聚木糖，河南源隆生物科技有限公司；抗性糊精、硅酸鈣，同發食化商貿有限公司；麥芽糊精，山東西王糖業有限公司；焦亞硫酸鉀、明膠、膨潤土、甘油，濰坊凱澤釀酒材料有限公司；果膠酶，湖南尤特爾生化有限公司；白砂糖，云南鳳慶糖業集團有限公司；DPPH，沃瑞達斯實驗試劑耗材；ABTS，酷爾化學科技（北京）有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒，南京建成生物工程研究所；硫酸亞鐵、水楊酸、過硫酸鉀、無水乙醇，均為分析純，銀川華廈化工有限責任公司。

儀器設備：DJ型雙道打漿機，江蘇漢隆機械制造有限公司；四連體發酵罐，武漢顯海機械設備有限公司；PHS-3E pH（酸度）計，上海儀電科學儀器股份有限公司；LPS-125CH真空冷凍干燥機，無錫萊浦儀器設備有限公司；YB-800B多功能粉碎機，永康市速鋒工貿有限公司；SJM-FHM陶瓷復合膜分離設備，合肥世杰膜工程有限責任公司；數顯折光儀，廣州市愛宕科學儀器有限公司；恒溫培養箱，力辰儀器科技有限公司；潔凈工作臺，濟南鑫貝生物技術有限公司；濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

本試驗采用工藝流程如圖1所示。

圖1 工藝流程圖

1.2.2 操作要點

原料處理：新鮮采摘或采摘后及時冷凍等方式保存完好的鮮枸杞，揀除霉爛果、葉柄以及石粒、鐵塊等雜物。噴淋清洗、榨汁后轉入發酵罐，加入0.05%異抗壞血酸鈉進行護色。執行巴氏殺菌工藝后，冷卻。

乳酸菌接種：冷卻至37℃，接種乳酸菌。

乳酸菌發酵：菌種接入后，控溫37℃、密閉無氧發酵。監測發酵醪滴定酸變化，滴定酸達到5 g/L時（以乳酸計），停止發酵。

陶瓷膜過濾：依次使用0.2%NaOH溶液、0.2%檸檬酸溶液、沸水清洗0.5 μm、0.2 μm膜孔徑規格陶瓷膜過濾設備。清洗完成后，進行過濾。透過液加入硫至體系中游離二氧化硫含量為40 mg/L后轉入清洗好的發酵罐中備用。截留液進行真空冷凍干燥，100目粉碎，使用低聚木糖25%、抗性糊精10%、麥芽糊精20%、硅酸鈣5%進行調配，調配完成后裝瓶。

降酸：陶瓷膜過濾后期，反復加水稀釋，對糖分進行洗脫，將透過液固形物含量降為5°Bx以下后，停止過濾。同時，稀釋過程也是降酸的過程，滴定酸控制為2.5 g/L。

酶解：發酵罐中加入50 mg/L果膠酶、復合酶，50℃酶解2 h。

發酵：0.1 g/L用量接種AC酵母，控溫15～18℃進行發酵。待比重降低至1050～1060 g/L時，按照酒精度12%vol計算，分次補充適量白砂糖。

調配：使用甘油對口感進行調整。

下膠：待發酵結束，加入硫至體系中游離二氧化硫含量為4 mg/L后，添加0.6 g/L膨潤土，執行下膠工藝。

陳釀：下膠結束的發酵原酒轉入儲酒罐，-4℃冷處理15～20 d，使冷不穩定性成分析出，同時有利于酒體陳釀。

除菌過濾：使用膜孔徑0.5 μm板框過濾機過濾，除去冷凍過程中析出的不穩定成分，膜孔徑0.2 μm微濾膜過濾除去酵母、細菌。

灌裝：除菌過濾后，進行無菌灌裝。

1.2.3 降酸方式的選擇

目前，果酒降酸的方式主要有化學降酸法、物理降酸法、生物降酸法、加水勾兌法[13-15]。化學降酸法對酒體口感、香氣破壞較大，不適用于枸杞酒這種內含物較單薄的酒體。物理降酸法可以應用于工業化生產的主要有冷凍法、吸附法。冷凍法主要針對酒石酸鹽含量豐富的酒體，吸附法會導致酒體香氣損失[16]。目前，還未見生物降酸應用于果酒工業化生產的報道。綜合考量，選擇加水勾兌法，在原料陶瓷膜處理階段降酸。在陶瓷膜過濾工段加水勾兌，一方面有利于枸杞汁中固形物的洗脫，另一方面可以充分混勻。

1.2.4 單因素實驗

通過預實驗，確定以降酸料液比、乳酸發酵時間、乳酸菌接種量為3個主要影響因素，以感官評價值為測試指標，確定發酵因素水平。

料液比：以20 DCU投料量發酵菌種加入發酵醪，37℃恒溫發酵24 h后，陶瓷膜過濾工段，加入2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5 體積比的純凈水降酸后進行發酵，測定酒體滴定酸與感官評價值。

發酵時間：以20 DCU投料量發酵菌種加入發酵醪，37 ℃恒溫發酵6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h，陶瓷膜過濾工段1∶1加水勾兌后進行發酵，測定酒體可滴定酸與感官評價值。

菌種接種量：以 10 DCU、20 DCU、30 DCU、40 DCU、50 DCU、60 DCU投料量發酵菌種加入發酵醪，37℃恒溫發酵24 h后，陶瓷膜過濾工段1∶1加水勾兌后進行發酵，測定滴定酸與感官評價值。

1.2.5 正交試驗

以降酸料液比、乳酸發酵時間、乳酸菌接種量為影響因素，采用正交試驗優化乳酸發酵枸杞汁的工藝，以感官評分值為指標，確定最佳發酵條件、因素、水平設置見表1。

表1 發酵工藝的試驗因素水平表

1.2.6 感官評定

請公司研發、質檢、生產部門無飲食偏好的人員共7人組成品評小組，按照表2對酒體的色澤、澄清度、香氣、口感進行綜合評定，去掉最高分、最低分后，取平均值作為評分結果。

表2 發酵酒的感官評定表

1.2.7 下膠實驗

以濁度值作為指標，采用膨潤土(A)單一使用以及膨潤土(A)與明膠(B)復配進行下膠、0.45 μm膜孔徑板框過濾，并對處理后的酒體進行澄清效果評價、感官評分。

1.2.8 理化指標分析

按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[17]分別測定寧夏紅12%vol金色傳杞酒（A）、乳酸菌發酵改良枸杞果酒(B)理化指標，并做對比分析。

1.2.9 微生物實驗

按照GB 4789.1—2016《食品微生物學檢驗總則》[18]、GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[19]、GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》[20]分別測定寧夏紅12%vol金色傳杞酒（A）、乳酸菌發酵改良枸杞果酒（B）菌落總數、霉菌和酵母數，并做對比分析。按照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[21]測定益生菌枸杞粉（C）中乳酸菌數。

1.2.10 穩定性實驗

1.2.10.1 蛋白穩定性（熱穩定性實驗）

取25 mL比色管加入25 mL酒樣，80℃水浴加熱30 min，24 h后進行觀察,若酒體澄清透明、無沉淀，則酒體蛋白穩定性合格。

1.2.10.2 氧化穩定性

取50 mL三角瓶裝入50 mL酒樣，加入0.2 mL 15%雙氧水，常溫觀察48 h，若酒體澄清透明、無沉淀，則酒體氧化穩定性合格。

1.2.10.3 微生物穩定性

離心管中裝入酒樣，在4000 r/min下離心15 min，若底部無沉淀，則微生物穩定性合格。

1.2.10.4 冷穩定性

酒體在-4℃下觀察7 d，不出現沉淀，則酒體冷穩定性合格。

1.2.10.5 銅穩定性

取25 mL比色管加入25 mL酒樣，加入0.1 mL的10%亞硫酸，常溫條件下放置一周后觀察，若酒體澄清透明、無沉淀，則酒體銅穩定性合格。

1.2.11 抗氧化分析

DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力的測定參照蘭永麗[22]的報道進行，ABTS自由基清除能力的測定參照何瑞[23]的報道進行，總抗氧化能力（FRAP法）的測定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，按照試劑盒的說明進行操作，分別測定乳酸菌發酵改良枸杞酒、寧夏紅12%vol金色傳杞酒DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、總抗氧化能力，并做對比分析。

1.3 數據處理

試驗采用 Excel、SPSS 23.0、Graphpad Prism 7對數據進行統計、處理。

2 結果與分析

2.1 發酵酒發酵實驗

2.1.1 單因素實驗結果

降酸料液比、乳酸菌發酵時間、乳酸菌接種量的單因素實驗結果見圖2、圖3、圖4，各因素對感官評分值均有顯著性影響（p＜0.05）。料液比為1∶1、乳酸菌發酵時間為24 h、乳酸菌接種量在20 DCU時為最佳發酵條件。

圖2 料液比對發酵酒感官品質的影響

圖3 發酵時間對發酵酒感官品質的影響

圖4 乳酸菌接種量對發酵酒感官品質的影響

2.1.2 正交實驗優化結果

以發酵酒的感官評分為指標，確定了影響發酵酒感官品質的因素順序為：發酵時間＞料液比＞乳酸菌接種量，最佳發酵條件為A2B2C1，即發酵酒的工藝條件為料液比1∶1，發酵時間24 h，乳酸菌接種量為20 DCU（表3），該條件下感官評分值為81分。

表3 發酵酒發酵工藝的正交試驗結果

對正交試驗所得工藝條件進行驗證性發酵，所得發酵酒感官評分為83分，與正交試驗結果相一致。

對感官評分進行方差分析（表4）可知，料液比、發酵時間、接種量均對感官評分有顯著性影響（P＜0.05）。

表4 感官評分方差分析

2.2 發酵酒釀造過程中基礎理化指標測定結果

如圖5、圖6、圖7表示，發酵酒釀造過程中基礎理化指標的變化，發酵過程中的pH值和總酸含量對酒體的口感、風味以及產品的貨架期均有較重要的影響。pH值在發酵過程中逐步降低，第11天降至最低，為3.94，然后逐漸上升直到發酵結束。與此同時，總酸在發酵0～8 d過程中逐漸增加，9～13 d逐漸減少，在最后2 d的發酵過程中有略微上升直到最終。總酸含量的增加主要是由于發酵過程中酵母產酸所致。發酵過程中，酵母不斷消耗糖分以及外源補糖，在發酵過程中總糖總體呈下降趨勢，至殘糖含量為4 g/L，不再發生變化。同時產生大量酒精，酒精度逐步上升（從0%vol到12.5%vol）。

圖5 發酵酒釀造過程中酒精度變化

圖6 發酵酒釀造過程中總酸、pH值變化

圖7 發酵酒釀造過程中總糖含量變化

2.3 下膠實驗

實驗結果見表5。根據下膠實驗結果，0.6 g/L膨潤土用作澄清劑，澄清效果最佳且用量最少，避免過量吸附對酒體的破壞。

表5 發酵酒下膠實驗結果

2.4 理化指標分析

對寧夏紅12%vol金色傳杞酒(A)、乳酸菌發酵枸杞酒理化指標(B)各項理化指標進行測定，測定結果見表6。乳酸菌發酵枸杞果酒滴定酸含量明顯高于寧夏紅12%vol金色傳杞。乳酸菌發酵枸杞果酒的干浸出物、色度指標要低于寧夏紅12%vol金色傳杞，可能與多次執行過濾工藝，導致部分物質的損失及水稀釋比例過高有關。

表6 理化指標對比分析

2.5 微生物檢驗分析

對寧夏紅12%vol金色傳杞酒(A)、乳酸菌發酵枸杞酒(B)、益生菌粉(C)各項微生物指標進行測定，測定結果見表7。兩款酒體的菌落總數、霉菌酵母菌數均低于80 CFU/750 mL，符合標準要求。益生菌粉中乳酸菌活菌數達3.1×107CFU/g,具備一定的保健功效。

表7 微生物指標對比分析

2.6 穩定性分析

對寧夏紅12%vol金色傳杞酒、乳酸菌發酵枸杞酒進行蛋白、氧化、微生物、冷、銅穩定性指標檢測，經處理后，2種酒體觀察過程中呈現澄清、透明，均未出現沉淀，酒體穩定性良好。

2.7 抗氧化性分析（圖8、圖9）

圖8 抗氧化能力對比分析

圖9 總抗氧化能力對比分析

經乳酸菌發酵所得酒體DPPH自由基清除率與現有產品無顯著性差異，ABTS自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力均顯著高于現有產品。抗氧化性能的測定結果與Kadyan[24]、Laaksonen等[25]的報道一致，乳酸菌發酵可以提升酒體的抗氧化性能。

3 結論

本實驗通過單因素實驗、正交實驗，確定乳酸發酵改良枸杞酒風味的最佳工藝參數為：降酸料液比1∶1、乳酸發酵時間24 h、乳酸菌接種量20 DCU，各因素對發酵酒感官影響的主次順序為：發酵時間＞料液比＞乳酸菌接種量。通過下膠實驗，確定最佳下膠方案為膨潤土0.6 g/L使用量下膠。發酵所得酒體滴定酸含量顯著高于現有產品，酸感更突出。干浸出物、色度指標低于現有產品，可能與多次執行過濾工藝及水稀釋比例過高有關。2款酒體菌落總數、霉菌酵母菌數檢測指標均低于80 CFU/750 mL，符合標準要求。益生菌粉中乳酸菌活菌數達3.1×107CFU/g，具備一定的保健功效。抗氧化實驗中，經乳酸菌發酵所得酒體DPPH自由基清除率與現有產品無顯著性差異，ABTS自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力均顯著高于現有產品，乳酸菌發酵可以提升酒體的抗氧化能力。

經乳酸菌發酵改良的酒體，呈金黃色，具有柑橘類水果香氣，酒香、果香馥郁柔和，口感爽口、清新，產品品質出色，具備較好的市場潛力。