功能菌養窖液中己酸產生途徑的證實及其在生產中的應用

程 凡，張溫清，梅 婕，周 萍

（安徽宣酒集團股份有限公司科研中心，安徽宣城242000）

濃香型白酒主要以高粱、小麥、大米、糯米、玉米為原料，經固態發酵、蒸餾、貯存、勾兌而成，具有己酸乙酯為主體的復合香氣，其“窖香優雅、綿甜爽凈、酒體柔和、協調”的風格特點深受消費者喜愛[1]。老窖出佳品，窖池越老，產酒的質量越好，這是濃香型白酒傳統工藝的經驗總結。隨著釀酒科技不斷進步，研究表明，老窖泥中己酸菌等厭氧功能菌在白酒的發酵生香中起著不可代替的作用[2]。

目前，對于己酸菌的研究主要集中在窖池微生態系統中新型高效己酸菌的篩選、發酵條件調控、己酸代謝途徑解析、己酸菌在濃香型白酒釀造及其他領域的應用等[3-4]。本實驗用于制作功能菌養窖液的微生物是以己酸菌為主的一組菌群，均選育自江南小窖釀造微生態系統，并保藏于本實驗室。目前，該組功能菌已用于日常功能菌養窖液的制作，養窖液中己酸的含量獲得了較大的提升，實際應用結果良好，大大提高了濃香型原酒的品質。因此，研究功能菌養窖液中高含量己酸的產生途徑，找到進一步提升養窖液中己酸的方法，有重要的實際意義和行業推廣價值。本研究采用液相色譜法和氣相色譜法連續跟蹤功能菌養窖液發酵過程中乳酸、乙酸、丁酸和己酸等指標的變化，并通過生物信息學手段，采用PAST軟件對樣品中各有機酸指標進行相關性分析，找出己酸的合成底物，推測己酸的合成途徑，最后通過不同底物添加實驗證實己酸的合成途徑。本研究得出乳酸、乙酸、丁酸、己酸之間具有顯著的相關性，證實了窖泥功能菌液以乳酸為底物合成己酸，乙酸、丁酸為其中間代謝產物，提高己酸菌的乳酸耐受，提高初始配方中乳酸的含量或選用高乳酸含量的黃水，是提高窖泥功能菌養窖液中己酸的重要手段。本研究為探究己酸菌代謝途徑，改良人工窖泥功能菌的制作工藝，加快人工窖泥老熟時間，提高人工窖泥的品質提供全新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品收集

己酸功能菌養窖液由本廠微生物制品中心提供，菌液混勻后，調節pH7.0，37℃密閉培養；添加實驗以乳酸0 g/L、5 g/L、10 g/L 3個濃度梯度添加（實際添加量以分析數據為準），取培養0 d、3 d、6 d、7 d的菌液為分析樣品。

1.1.2 試劑及耗材

乙醇（色譜純），二氯甲烷（色譜純），甲酸（色譜純），乙腈（色譜純），乙酸、丁酸、己酸、乳酸等標準品（純度≥90%）；MRS培養基、營養瓊脂培養基均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗室用水由實驗室專用純水機制備。

1.1.3 儀器設備

氣相色譜儀，日本SHIMADZU GC-2010 Plus，FID檢測器，色譜柱AgilentDB-FFAP，30m×0.25mm；氫氣發生器QPH-500Ⅱ型，空氣發生器QPA-5LP型，上海全浦科學儀器有限公司；液相色譜儀，Agilent HPLC-1206，配DAD檢測器，色譜柱Agilent Poroshell 120 EC C18；隔水式恒溫培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；離心機TG16-WS，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 試驗方法

菌液樣品前處理及色譜分析條件參考本團隊之前的分析方法[5-6]。取分析樣品10 mL于離心管中，8000 r/min離心20 min。取上清液待用。經稀釋、水膜過濾后，采用HPLC-DAD測定菌液中乳酸的含量；其他揮發性香味成分，如己酸、乙酸、己酸乙酯等經萃取后，采用GC-FID進行測定。乳酸菌、己酸菌、細菌等微生物數量測定參照已報道的相關文獻[7-8]。

2 結果與分析

2.1 功能菌養窖液制備過程中樣品的指標分析

對功能菌養窖液不同發酵階段的酸、酯及菌落各項指標跟蹤測定，采用PAST軟件對樣品測定的數據進行相關性分析。r＞0.6表明具有相關性，±表示正負相關性；p＜0.05表示呈顯著相關。其結果如表1所示。

表1 功能菌液中各指標相關性系數分析

由表1可知，己酸與培養時間、己酸乙酯、乙酸、丁酸呈正相關，與乳酸乙酯呈負相關，其中己酸與培養時間和丁酸呈顯著相關性；乳酸與培養時間、己酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸呈負相關，與乳酸乙酯呈正相關，且乳酸與己酸呈顯著相關性；功能菌液中的己酸菌平均分布與培養時間、己酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸呈負相關，己酸菌與乳酸乙酯、乳酸呈正相關，并且與培養時間、己酸乙酯、丁酸、己酸都具有顯著相關性。

根據功能菌液制備過程中己酸菌分布情況分析，如圖1所示，隨著培養時間的延長，己酸菌與細菌總數降低，乳酸菌在發酵前期表現較強的生物活性；3 d以后，乳酸菌總數呈明顯下降趨勢，己酸菌總數逐漸上升，細菌總數重新恢復穩定，乙酸、丁酸、己酸含量穩定增長，如圖2所示。

圖1 功能菌液制備過程中微生物分布圖

圖2 功能菌養窖液制備過程中4種有機酸變化趨勢

2.2 功能菌液乳酸添加實驗

綜合以上分析結果，己酸功能菌液在制備過程中必然存在乳酸、乙酸、丁酸和己酸四者之間的代謝關系。結合相關文獻[2，4]，推測功能菌養窖液存在乳酸-乙酸-丁酸-己酸的代謝途徑。為進一步明確功能菌液是否能利用乳酸為底物合成己酸，我們通過開展以下乳酸添加實驗加以證實。

實驗取入罐前的功能菌培養液，按照1.1.1所述添加乳酸純物質，調節初始pH值為7.0，37℃密閉發酵6 d，同上，取培養0 d、3 d、6 d菌液，進行酸、酯等相關指標分析，結果如表2所示。不同濃度乳酸添加后，隨著培養時間的延長，功能菌液中乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯含量都呈下降趨勢，乳酸乙酯稍有生成；發酵3 d，菌液中乳酸含量急劇降低，發酵6 d，乳酸全部被消耗；菌液中的乙酸在培養前3 d表現為初始乳酸含量越高，乙酸消耗越快，6 d后基本達到平衡；丁酸濃度保持持續升高狀態，6 d后也基本保持數值穩定；己酸含量明顯得到提升，且3個濃度添加試驗的乳酸-己酸轉化率分別為42.0%、46.5%和44.8%，說明乳酸最終全部轉化為己酸，且明顯提升了總酸含量。說明功能菌液發酵前期，受乳酸濃度的影響，乳酸、乙酸急速消耗，產生大量的丁酸和己酸；發酵后期伴隨著乳酸的完全消耗，乙酸、丁酸含量逐漸趨于穩定，己酸含量達到最高峰。整個發酵過程中酯類物質的變化較小，其原因可能與功能菌液中醇類物質含量較低存在關系。綜上所述，本次乳酸添加實驗進一步證實了功能菌液中的己酸菌可以利用乳酸為發酵底物生成己酸，存在乳酸-乙酸-丁酸-己酸的微生物代謝途徑。

表2 乳酸添加試驗不同發酵時間功能菌液中相關物質分級結果

3 結果與討論

本研究針對本廠分離優化的新型己酸功能菌養窖液中有機酸、酯等指標的綜合分析，開展功能菌液中己酸代謝途徑方面的研究，利用PAST軟件對樣品測定的數據進行相關性分析，再結合乳酸添加實驗，證明了該己酸功能菌液可以利用以乳酸為底物生成己酸；也證實了以乳酸為底物，乙酸、丁酸為中間產物，己酸為終產物的發酵代謝途徑。這項發現為白酒風味骨架成分己酸、己酸乙酯產生機理的研究和功能菌液生產工藝改進提供新的發展方向；而且本研究中所采用的新型己酸菌的加入不僅可以增加人工窖泥中己酸的產量，而且豐富了窖泥微生物群落；其平均44.4%的乳酸-己酸轉化率為縮短人工窖泥老熟的培養時間，指導濃香型白酒窖泥老熟工藝的調整具有實際意義。此外，實際生產中有意識的提高培養液中底物乳酸的含量（或高乳酸含量黃水的用量），增加己酸功能菌群的底物耐受性，是快速、有效提高功能菌養窖液中己酸含量的有效手段，具有行業推廣意義。