PCR-DGGE技術分析人工無機窖泥梭菌多樣性

呂志遠，任廣花，蘇 寧，張 捷，張夢夢，崔吉鵬，吳玉軒，商海林

（濟南趵突泉釀酒有限責任公司，山東濟南250115)

濃香型白酒以“窖香濃郁，綿甜醇厚，香味協調，回味悠長”的風格特征著稱，其產量占中國白酒總產量的70%以上，深受消費者喜愛[1]。濃香型白酒的香氣成分主要來源于發酵過程中微生物的代謝作用，其典型主體香味窖香主要由窖泥微生物代謝產生[2]。窖泥是酒體生香功能微生物的繁殖載體，棲息著梭菌、擬桿菌、芽孢桿菌、甲烷桿菌等眾多的厭氧微生物，對濃香型白酒質量起著至關重要的作用[3]。然而窖池泥經過生產發酵容易出現老化、退化現象，因此工廠會使用人工窖泥對窖池進行周期性的修補養護。該環節會為窖池引入大量有益微生物和營養物質，在一定程度上改變窖池泥的微生態系統，進而影響發酵過程。研究證實，將優質的人工窖泥用于新建或改建窖池，效果顯著，能改善窖池泥風味和新產酒的酒體風格，增強窖池泥的酯香味，增加新酒香味成分的同時比例更協調[4-5]。

梭菌綱群落是窖泥中一類重要的微生物族群，能利用多種碳水化合物產生各種代謝產物[6]，如C.Kluyveri、C.yrobutyricum具有高產丁酸、己酸的能力，是濃香型白酒釀造過程中重要的風味貢獻者[7-8]。研究證實，濃香型白酒的質量與窖泥中的梭菌綱群落密切相關，任聰等[9]發現老窖泥中梭菌綱微生物占主導地位，Hu等[10]通過高通量測序技術對不同質量窖泥微生物多樣性進行研究發現窖泥質量與窖泥中優勢梭菌菌群相對含量之間存在較好的正相關性。因此，梭菌是白酒釀造過程中的重要功能菌。本研究以自然發酵的人工無機窖泥為試驗材料，利用PCR-DGGE技術分析窖泥在發酵過程中梭菌的生物多樣性及變化規律，以期為人工窖泥技術開發提供參考，為人工調控窖泥微生物群落影響窖池泥的微生態系統進而調節白酒品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：所用的窖泥樣本均取自本廠某一泥房中，窖泥樣品分別為窖泥制備0 d、10 d、20 d、30 d、40 d、50 d、60 d，共 8個窖泥樣品，樣品編號為1—8。采樣方法為：窖泥表面下方20 cm窖泥平面中，五點取樣（每份約50 g），將窖泥轉入無菌塑封袋混勻后，立即放置-20℃冷凍保存。

試劑及耗材：Easytaq DNA聚合酶、高保真聚合酶、DNA Maker、GelStain染液、pEASY-T1 Cloning Kit、AMP、IPTG，北京全式金生物技術有限公司提供；DNA提取試劑盒、DiaSpin柱式PCR產物純化試劑盒、EZ-10柱式DNA PAGE膠回收試劑盒、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、尿素、四甲基乙二胺、過硫酸銨（均為分析純）、引物合成與測序，生工生物工程(上海)股份有限公司。

儀器設備：高速冷凍離心機，德國Sigma公司；T100型PCR擴增儀、DCodeTM System突變檢測系統及凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；DYCP-31 E型瓊脂糖電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.2 變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）及圖像分析

將窖泥樣品迅速解凍后，稱取0.2 g，使用土壤提取試劑盒按照說明書進行窖泥總DNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于-20℃保存。

就是石頭粉，沒有化學成分，安全可靠，微粒結構可以保護腸道黏膜和吸附細菌病毒，特別當有便血的時候，說明有腸黏膜損傷，更是需要蒙脫石散來保護腸黏膜。但是后期用量建議比說明書上的稍減，否則很容易引起便秘。正因為可以吸附細菌病毒，連腸道有益菌也會吸附，所以服用蒙脫石散2小時后應使用益生菌調節腸道菌群。

從凝膠上切取目的條帶，用無菌超純水清洗后，進行膠回收，以不含GC夾子的SJ-F/SJ-R的引物進行PCR擴增。擴增產物經純化后，連接至pEASY-T1載體，連接產物轉化至Trans1-T1感受態細胞，經藍白斑篩選和M13F/R引物PCR檢測后得到的陽性克隆子于LB培養液中培養，菌液送交生工測序公司測序測定。將獲得的序列在NCBI數據庫中進行BLAST同源性比對。使用MEGA 5軟件以鄰接法構建系統發育樹，進行系統發育分析。

以提取的窖泥總DNA為模版，使用含GC夾子的梭菌特異性引物SJ-F-GC/SJ-R擴增16S DNA V4—V5區[3]。擴增體系和擴增程序參照盧振的條件[11]。待PCR結束后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物的質量。

1.2.1 窖泥微生物總DNA提取及PCR擴增

窖泥總DNA經PCR擴增后獲得的16S rRNA V4—V5區目的基因片段長度為320 bp左右（圖1），與理論結果一致。擴增效果良好，清晰無雜帶，可滿足后續試驗分析。

利用Quantity one 4.6.2軟件對圖片進行分析，根據條帶的數量及灰度計算樣品的Shannon-Wiener多樣性指數（H）、Simpson辛普森指數（D）、Pielou均勻度指數（E），表征窖泥中梭菌群落多樣性。采用UPGMA算法對圖譜進行聚類，分析不同培育時期窖泥的相似性系數（CS）。

瑞豐生態（集團）營銷中心總監胡學敏表示，瑞豐生態將會以土壤修護研究院為核心，打造中國規模最大的基層土壤修護服務體系，通過項目建設、技術指導和現場服務的方式，憑借以產品為核心的服務體系解決土壤和種植問題，幫助傳統經銷企業轉型成為經銷服務商，實現企業、經銷商和農民等多方的融合共贏。

從不同培育時期的窖泥中選取亮度高、分離清晰的條帶（見圖2），經切膠回收、PCR產物純化、連接轉化、測序后，將測序結果在NCBI上進行BLAST比對，測序結果見表2。

1.2.3 DGGE條帶序列測定與分析

我們用東北地震的數據集說明，這個方法對于單個地震事件也是有效的。相應的質點分布快照圖和估計參數的時間序列見圖8和圖9。由于這次地震為近海地震，因此在參數的初步估計中，有相當大的定位誤差。但是在初至P波到達后40s，平均誤差開始下降。隨著地震破裂擴展，震級估計值由6.0增大到了8.4，這與地震破裂的機制相吻合。而估計的5個參數值均與日本氣象廳地震目錄中的值接近。

2 結果與分析

2.1 窖泥16S rRNAV4—V5區PCR擴增

DGGE的操作參照盧振的方法[11]，略有修改：聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑濃度梯度為50%～55%，PCR產物上樣量為40 mL。待1×TAE緩沖液加熱至60℃后，將初始電壓設置為20 V，電泳20 min后，再將電壓調至60 V，電泳15.5 h。電泳結束后使用Gelatain染液泡染。將凝膠染色40 min后清水脫色30 min，利用凝膠成像系統拍照，保存圖像。

圖1 16S rRNA基因片段擴增電泳圖

2.2 DGGE指紋圖譜豐度及優勢度分析

通過DGGE指紋圖譜，可以清晰的比較新泥在發酵過程中梭菌的群落組成及豐度的變化規律（圖2）。不同發酵時間的窖泥經PCR-DGGE電泳分離后可得到32條不同位置的條帶，這些條帶在不同發酵時間的優勢度值不同，分別代表各自的發育動態（表1）。8號、9號、24號菌株優勢度值在新泥發酵10 d后的樣品中均維持較高水平，優勢度在2.89～14.66之間，表明它們是人工窖泥發酵過程中的優勢菌群，說明配制窖泥中的營養物質及所在的環境均利于這3種菌的生長，這些菌是特征菌群，對窖泥的特性起重要作用。1號、2號、5號、25號、26號、29號、31號菌株在新泥發酵第10天時含量達到最高值，之后變成微量，這些菌未能在發酵過程中持續存在，其他菌一直處于動態變化過程，說明原窖泥中的微生物大部分都能在窖泥中生長。

圖2 窖泥樣品梭菌DGGE指紋圖譜

表1 窖泥樣本DGGE圖譜的豐度及優勢度

2.3 窖泥梭菌DGGE指紋圖譜多樣性指數以及相似性比較

多樣性分析結果如圖3所示，窖泥樣品的Shannon-Wiener多樣性指數在2.19～3.15之間，Simpson優勢度指數指數在0.89～0.96之間，PieLou均勻度指數在0.97～0.99之間。多樣性指數（H）表現出一定的差異，而優勢度指數（D）和均勻度指數（E）非常接近。新配制的窖泥中生物的種類、多樣性及物種豐富度最好，香農指數和辛普森指數均為最高，微生物種類最豐富，個體分布最均勻。隨著發酵的進行，呈現先下降后螺旋上升的變化過程。可能是不同的微生物物種適應窖泥環境的能力和時間不同。

圖3 窖泥梭菌群落多樣性指數

本研究基于DGGE指紋圖譜的條帶光密度值對8個不同發育時期的樣品進行聚類，聚類結果如圖4。樣品1、樣品2、樣品3聚為一簇，相似度低于0.52；6聚為一簇；4和7聚為一蔟，相似度為0.66；5和8聚為一簇，相似度為0.72。一般認為相似度高于0.60的群體具有較好的相似性[12]，在發酵前期（前10 d）差異不明顯，隨著發酵的進行，窖泥中細菌間的相互作用逐漸趨于平衡，逐步形成不同的群落結構。由此可見，人工窖泥發酵過程中菌群有一定的親緣性，菌落結構變化較小。

圖4 不同窖泥梭菌群落相似性指數樹狀圖

2.4 窖泥梭菌DGGE圖譜優勢菌測序分析

1.跨境貿易人民幣結算量分析。如圖5所示，2012～2016年，廣西與東盟國家跨境人民幣結算量一直呈增長態勢，規模從2012年的615.77億元增長到2016年的1259.62億元。但增速放緩，在2013年達到高點后，2015年、2016年連續呈現低迷狀態。根據最新數據，2017年上半年廣西與東盟跨境人民幣結算量為569.07億元，同比下降23.24%，呈現負增長態勢。

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表2 DGGE條帶序列NCBI數據庫Blast結果

利用SJ-F/R擴增到29種微生物，包括厚壁菌門中的梭菌綱和Negativicutes；擬桿菌門中的黃桿菌綱和放線菌門的微球菌目、鏈霉菌目、棒桿菌目及紅色桿菌綱的細菌。Veillonellaceae原屬于梭菌第九簇，因此條帶4-26均為梭菌綱微生物，這些條帶占大部分且位于圖譜的中間位置，因此引物SJF/R和DGGE電泳條件基本符合擴增和分離梭菌的要求。

在整個發酵過程中檢測到的梭菌在科水平上有：梭菌科（Clostridiaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、真桿菌科（Eubacteriaceae）、瘤胃菌科（Rumi-nococcaceae）、Gracilibacteraceae、消化球菌科（Peptostreptococcaceae）、Tissierellales和韋榮氏菌科（Veillonellaceae）。其中梭菌科含量最多，其次是毛螺菌科和真桿菌科（圖5）。在屬水平上有：梭菌屬（Clostridium）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、羅氏菌屬（Roseburia）、醋弧菌屬（Acetivibrio）、Alkalibaculum、Gracilibacter、Anaerocolumna、Sporanaerobacter、Sedimentibacter、互營球菌屬（Syntrophococcus）厭氧醋菌屬（Acetoanaerobium）、真桿菌屬（Eubacterium）以及巨型球菌屬（Megasphaera），其中梭菌屬的種類和含量最多。

圖5 不同發酵時間科水平梭菌綱群落組成

2.5 窖泥DGGE圖譜優勢條帶系統發育學分析

將本實驗測得的梭菌綱微生物（含韋榮氏菌）的16S rRNA區域序列與NCBI最相近的模式種序列建立系統發育樹，結果如圖6所示，所有條帶序列與相應參考序列同源性很高，并與其聚在一起，證明梭菌16S rRNA區域序列分析結果的準確性。其中12號（uncultured bacterium）與5號（梭菌科）和21號（毛螺菌科）聚為一類，相似性在37%～54%之間，因此不能明確12號細菌的分類狀態。

纖維蛋白原是由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質，研究顯示：當血漿纖維蛋白原升高時，靜脈血栓疾病發生危險增加4倍[23]。分析2項[17,20]半隨機對照試驗設定的“每日1次，每次1 h”“每日2次，每次40 min” “每日3次，每次2 h”3種治療策略對骨科大手術病人纖維蛋白原的影響，Meta分析結果顯示：“每日2次，每次40 min”或“每日3次，每次2 h”對降低纖維蛋白原水平有一定作用。但因2項研究樣本量均較小，對此結果應持慎重態度，在臨床研究和實踐中還需做更多原始研究予以驗證。

圖6 窖泥中梭菌16S rRNA的系統發育樹

經查閱資料可知，屬于梭菌科的梭菌屬是一類厭氧菌，能利用多種碳源、蛋白質等物質合成多種脂肪酸、醇類以及CO2等產物，能利用乙醇和乙酸等有機酸，生成濃香型白酒主要香味成分丁酸乙酯和己酸乙酯，是重要的釀酒功能菌[13]。Clostridium sartagoforme能直接利用不同碳源，尤其是利用纖維素產丁酸、己酸[14]；Clostridium tyrobutyricum、Clostridium novyi為四川瀘州20～300年窖泥中篩選出高產己酸菌[15]；Clostridium luticellarii能產生丁酸、乙酸和丁二醇等小分子的酸或者醇，該菌在四川窖底泥中篩選出[16]。屬于毛螺菌科的Butyrivibrio和Roseburia發酵主要產生丁酸；Anaerocolumna aminovalerica能發酵產生乙酸、乙醇和H2[17]；Syntrophococcus分解糖類、淀粉產生乙酸，與甲烷菌共生[18]。屬于真桿菌科的Alkalibaculum能發酵產生乙醇、乙酸、戊酸、己酸[19]；Eubacteriumsp發酵代謝的主要產物為丁酸、乙酸或甲酸[20]。屬于泰式菌科的Sporanaerobacter能利用糖類、多肽和氨基酸等把硫還原為硫化物轉化生成乙酸、異丁酸和異戊酸等[21]；泰式菌未知分科的Sedimentibacter acidaminivorans屬于可利用氨基酸發酵產生乙酸和丁酸[22]。韋榮氏菌科的Megasphaera是一種產己酸的菌株[23]。瘤胃菌科的Acetivibrio ethanolgignens發酵產乙酸。Gracilibacteraceae科的Gracilibacter能發酵產生乙醇、乙酸等物質[24]。由此可知，檢測出的菌以產丁酸和己酸的菌居多。研究表明，己酸菌和丁酸菌對濃香型白酒香氣貢獻最大[8]。己酸與乙醇酯化合成的己酸乙酯是濃香型白酒主體香味成分；丁酸合成的丁酸乙酯也是白酒主要香味物質之一；丁酸亦是某些菌合成己酸和己酸乙酯的前體物質；代謝產生的二氧化碳能營造低氧環境，利于自身生長的同時還能減緩乙醇氧化，提高出酒率[25]。因此配制的人工窖泥里含有大量的釀造功能菌。

3 結論

本實驗采用PCR-DGGE技術初步解析了人工無機窖泥在發酵過程中梭菌的生物多樣性及其變化規律，結果表明，人工窖泥中含有豐富的梭菌資源，在科水平上梭菌科含量最多，其次是毛螺菌科和真桿菌科。在屬水平上有梭菌屬（Clostridium）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、羅氏菌屬（Roseburia）、醋 弧 菌 屬（Acetivibrio）、Alkalibaculum、Gracilibacter、Anaerocolumna、Sporanaerobacter、Sedimentibacter、互營球菌屬（Syntrophococcus）厭氧醋菌屬（Acetoanaerobium）、真桿菌屬（Eubacterium）以及巨型球菌屬（Megasphaera），其中梭菌屬的種類和含量最多。大部分梭菌均能在窖泥中生長并呈現不同的發育動態，梭菌屬、丁酸梭菌、真桿菌是發酵過程中的優勢菌，對窖泥的特性起主要作用；結合相關軟件分析表明，不同發酵時間梭菌多樣性指數存在差異，呈現先下降后螺旋上升的變化過程，優勢度和均勻度比較接近。人工窖泥發酵過程中菌落結構變化較小。通過系統發育樹可知，各細菌之間具有一定的親緣關系。此結果有助于人們根據工廠需要采取調整窖泥營養條件、發酵條件、添加功能菌液等措施來優化改良人工無機窖泥。