桉樹木屑與枯草芽孢桿菌結(jié)合對豬肚菇生長影響

盧中強，唐 璇，韓美麗，鄧莉杰，陸榮生，霍秀娟，王燦琴

（1.廣西壯族自治區(qū)國有高峰林場，廣西南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學院微生物研究所，廣西南寧 530007）

豬肚菇（Clitocybe maxima）是一種食藥兼用的高溫型食用菌品種，近年在華南地區(qū)大量種植。豬肚菇富含各種氨基酸、多糖等營養(yǎng)成分，其菌蓋中的氨基酸含量占干物質(zhì)的16.5%，其中必需氨基酸占氨基酸總量的45%，高于大多數(shù)食用菌。除食用外，豬肚菇子實體中含有多糖、生物堿等多種藥理活性成分，具有一定的抗癌作用[1]。豬肚菇傳統(tǒng)代料栽培原料為棉籽殼、玉米芯等材料[2-3]，因此對于非產(chǎn)棉區(qū)及玉米種植較少的地區(qū)，尋找替代原料以降低生產(chǎn)成本是豬肚菇栽培中需解決的問題之一。

桉樹（Eucalyptus）是一種速生樹種，主要用于造紙及木材加工，在廣西大量種植，廣西桉樹木材年產(chǎn)量超過2 000 萬m3，占全國的1/4。桉樹木材加工過程中產(chǎn)生大量以桉樹皮為主要成分的木屑，這些廢棄物大部分被直接焚燒或丟棄，造成環(huán)境污染的同時，也給有機資源造成浪費[4]。現(xiàn)有研究表明，桉樹木屑含有接近食用菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)[5]，近年來已有一些采用桉樹木屑進行食用菌栽培的報道[6-8]，桉樹栽培食用菌中存在的主要問題是產(chǎn)量低，如平菇生物轉(zhuǎn)化率只有35%～38%（同類棉籽殼培養(yǎng)基可達120%左右）、赤靈芝只有20%（同類雜木屑培養(yǎng)基可達65%左右）[9]。目前尚無桉樹木屑在豬肚菇上的應(yīng)用報道。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis）屬于革蘭氏陽性菌，是一種益生菌，其發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量內(nèi)生消化酶，通過降解飼料中復雜有機物而提高發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)、增強動植物免疫力和抗病力等[10]，在飼料、肥料等領(lǐng)域中均有廣泛的應(yīng)用。筆者針對桉樹木屑自然發(fā)酵產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化率低的問題，以豬肚菇為對象，在桉樹木屑發(fā)酵過程中添加不同濃度枯草芽孢桿菌菌劑，探討發(fā)酵培養(yǎng)料對菌絲生長與生物轉(zhuǎn)化率的影響，旨在為桉樹木屑微生物發(fā)酵處理方法在豬肚菇及其他食用菌栽培上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用豬肚菇ZG-12 號為廣西農(nóng)科院微生物研究所研究室保存菌株，所用桉樹木屑由廣西國有高峰林場木材加工廠提供。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 不同濃度枯草芽孢桿菌菌劑處理桉樹木屑后發(fā)酵產(chǎn)物對豬肚菇出菇袋菌絲生長的影響。在桉樹木屑中添加不同濃度活化后的枯草芽孢桿菌菌劑進行發(fā)酵（發(fā)酵時間統(tǒng)一為6 d），將發(fā)酵產(chǎn)物添加到出菇袋培養(yǎng)基中，觀察其對菌絲生長的影響。以棉籽殼基本培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基，配方為：1 kg 培養(yǎng)料中含棉子殼825 g、米糠150 g、過磷酸鈣10 g、石膏10 g、石灰5 g。桉樹木屑發(fā)酵中，不同處理枯草芽孢桿菌的添加量分別為0、3.0、5.0、8.0、11.0、15.0、18.0 g/kg。枯草芽孢桿菌加入桉樹木屑前活化培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)溫度28℃～30℃，搖床轉(zhuǎn)速120 rpm。

1.2.2 枯草芽孢桿菌菌劑與桉樹木屑混合發(fā)酵時間對出菇袋菌絲生長與生物轉(zhuǎn)化率的影響。在出菇袋培養(yǎng)基中添加枯草芽孢桿菌菌劑與桉樹木屑不同混合發(fā)酵時間下所產(chǎn)生的桉樹發(fā)酵物，觀察其對菌絲生長與生物轉(zhuǎn)化率的影響。對照培養(yǎng)基及各處理培養(yǎng)基同1.2.1，發(fā)酵時間為0、4、6、8、10、12、14、16 d，共8 個處理。

1.2.3 枯草芽孢桿菌菌劑與桉樹木屑混合發(fā)酵過程中，不同濃度牛糞與尿素的添加對桉樹木屑發(fā)酵產(chǎn)物對豬肚菇出菇袋菌絲生長、生物轉(zhuǎn)化率應(yīng)用上的影響。對照培養(yǎng)基及處理培養(yǎng)基同1.2.1，桉樹木屑發(fā)酵中，牛糞添加量分別為30、60、90、120、150 g/kg，尿素添加量分別為5、10、15、20、25 g/kg。在1.2.2 選出的發(fā)酵天數(shù)下發(fā)酵，觀察發(fā)酵產(chǎn)物對菌絲生長與生物轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3 枯草芽孢桿菌菌劑與桉樹木屑混合發(fā)酵的方法

不同濃度枯草芽孢桿菌菌液與桉樹木屑混合發(fā)酵產(chǎn)物制作：將活化的枯草芽孢桿菌接入桉樹木屑堆中，并添加0.2%蔗糖、0.1%磷酸二氫鉀，堆料含水量60%～65%，24 h 翻拋1 次，發(fā)酵時間按各處理定，發(fā)酵時室內(nèi)的溫度均為28℃～32℃。發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵產(chǎn)物用于出菇袋培養(yǎng)基配制。

1.4 出菇袋培養(yǎng)基配制

按配方稱取各成分后拌勻，加水至培養(yǎng)料含水量60%～65%，將培養(yǎng)料裝入23 cm×50 cm 規(guī)格聚丙烯菌袋，121℃消毒3 h ，培養(yǎng)基冷卻至室溫后接種培養(yǎng)。菌絲培養(yǎng)溫度均為24℃～28℃，黑暗環(huán)境。

1.5 出菇管理

將長滿菌絲出菇袋除去塑料袋，取出的菌柱平放放入筐中，表面覆蓋厚度2～3 cm 厚消毒過的濕壤土，3～5 d淋一次透水。出菇期間溫室溫度保持在28℃～32℃，空氣溫度80%～90%。采收2 批。

1.6 考察指標

試驗中，菌種活力恢復所需時間指菌種接種至開始在新培養(yǎng)基上生長所需時間；菌絲在培養(yǎng)基上生長情況調(diào)查中，出菇袋于接種后第7 天進行。

菌絲生長狀況：“+”—菌絲生長弱；“++”—菌絲生長較健壯；“+++”菌絲生長健壯；

生物轉(zhuǎn)化率=2 次采收的子實體鮮重（g）/培養(yǎng)料干重（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度枯草芽孢桿菌菌劑處理桉樹木屑的發(fā)酵產(chǎn)物對豬肚菇出菇袋菌絲生長的影響

將栽培菌種接入到添加不同枯草桿菌處理過的桉樹木屑發(fā)酵物為主要成分的出菇袋中培養(yǎng)，3～5 d 后可觀察到大部分處理接種菌塊菌絲恢復生長，6～8 d 左右菌絲開始在新培養(yǎng)基上生長。不同處理接種菌塊菌絲恢復活力所需時間與菌絲在培養(yǎng)基上的生長速度有較明顯的不同。

從表1 可看出，桉樹木屑發(fā)酵過程中添加枯草芽孢桿菌菌液所產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物可提高菌塊定植力及菌絲生長速度。枯草芽孢桿菌菌液添加量7.0、9.0、11.0 g/L 的3個處理接種菌塊恢復活力所需時間分別為4.8、4.6、5.0 d，明顯少于對照及其他處理，3 個處理之間無明顯差異；枯草芽孢桿菌菌液添加量7.0、9.0 g/L 的2 個處理菌絲生長速度分別達到7.3、7.5 mm/d，明顯高于對照及其他處理，2個處理之間無明顯。

表1 不同濃度枯草芽孢桿菌菌液處理的桉樹木屑發(fā)酵物對豬肚菇出菇袋菌絲生長影響

可見，桉樹木屑發(fā)酵過程中，枯草芽孢桿菌添加的適宜劑量為7.0～9.0 g/kg，該濃度范圍內(nèi)，不僅菌塊恢復生長時間縮短，菌絲生長速度及健壯程度也有所增加。

2.2 枯草芽孢桿菌菌劑與桉樹木屑混合后不同發(fā)酵時間產(chǎn)生的發(fā)酵物對出菇袋菌絲生長與生物轉(zhuǎn)化率的影響

栽培菌種接入以枯草芽孢桿菌不同發(fā)酵時間產(chǎn)生的桉樹木屑發(fā)酵物為主要培養(yǎng)成分的出菇袋培養(yǎng)基上后，可以觀察到發(fā)酵時間變化所產(chǎn)生的培養(yǎng)料對菌絲生長與生物轉(zhuǎn)化率有明顯的影響。

從表2 可看出，枯草芽孢桿菌添加量為7.0 g/kg 的情況下，發(fā)酵時間8、10、12 d 的處理菌塊恢復生長時間分別為：4.4、4.2、4.4 d，明顯比對照與其他處理有所縮短，三者之間無顯著差異；這3 個處理菌絲生長速度分別為8.1、8.0、7.8 mm/d，明顯高于對照及其他處理，且菌絲生長健壯，三者之間也無明顯差異。發(fā)酵時間6、14 d 2 個處理菌塊恢復生長時間次之，無明顯差異；二者菌絲生長速度分別為7.2、6.0 mm/d，同時發(fā)酵時間為14 d 的處理菌絲生長較弱。發(fā)酵時間為16 d 的處理不僅菌絲生長速度與對照無差異，而且菌絲最弱。

表2 桉樹木屑添加枯草芽孢桿菌后不同發(fā)酵時間對菌絲生長與生物轉(zhuǎn)化率的影響

在生物轉(zhuǎn)化率方面，枯草芽孢桿菌添加量為7.0 g/kg的情況下，發(fā)酵時間10、12 d 處理生物轉(zhuǎn)化率分別為62.4%、64.6%，明顯高于對照與其他處理，二者之間無顯著差異。發(fā)酵時間8 d 的處理生物轉(zhuǎn)化率僅次于10、12 d 處理。

綜上可以認為，枯草芽孢桿菌菌劑與桉樹木屑的混合發(fā)酵時間以10～12 d 為宜。這個時間段內(nèi)的發(fā)酵產(chǎn)物不僅促進菌種快盡早定植，也能促進菌絲生長及提高生物轉(zhuǎn)化率。

2.3 枯草芽孢桿菌菌劑與桉樹木屑的混合發(fā)酵過程中，牛糞與尿素的添加對發(fā)酵產(chǎn)物促進生長效果的影響

從表3 可以看出，發(fā)酵時間為10 d 時，枯草芽孢桿菌菌劑與桉樹木屑混合發(fā)酵時牛糞添加量為30、60、90 g/kg的3 個處理，菌袋成品率分別達94.7%、96.2%、97.8%，高于其他2 個處理，且與對照無明顯差異；牛糞的添加量為60、90 g/kg 的處理菌絲生長速度在所有處理中最高，分別為10.2、10.8 mm/d，二者無明顯差異；牛糞的添加量為30g/kg 的處理菌絲生長速度次之。牛糞的添加量為90 g/kg的處理生物轉(zhuǎn)化率達69.8%，在所有處理中最高，牛糞的添加量為60 g/kg 次之。

表3 含氮添加物對枯草芽孢桿菌與桉樹木屑混合發(fā)酵物促進生長影響

枯草芽孢桿菌菌劑與桉樹木屑混合發(fā)酵時尿素添加量為5、10、15、20、25 g/kg 的5 個處理，菌袋成品率分別達95.2%、95.8%、96.5%、97.9%、96.7%，且與對照無明顯差異；尿素的添加量為15、20 g/kg 的2 個處理菌絲生長速度在所有處理中最高，分別為11.4、11.7 mm/d，二者無明顯差異，均高于添加牛糞的最高菌絲生長量；二者的生物轉(zhuǎn)化率達64.7%、66.8%。

綜上，縮合菌包成品率、菌絲生長速度、生物轉(zhuǎn)化率3個方面的因素，枯草芽孢桿菌菌劑與桉樹木屑混合發(fā)酵時，以添加牛糞60～90 g/kg 為首選，添加尿素15、20 g/kg為次選。

3 結(jié)論與討論

（1）桉樹砍伐加工后產(chǎn)生的桉樹皮及木屑，可用于食用菌生產(chǎn)，但單純加入未處理或自然發(fā)酵的桉樹木屑時，食用菌菌絲生長較弱，生物轉(zhuǎn)化率也較低，該次試驗也證實了這一點。對于豬肚菇，采用發(fā)酵后的桉樹木屑并添加一定量麥麩的條件下豬肚菇菌絲才能正常生長并取得較好的生物轉(zhuǎn)化率。前人利用桉樹木屑進行食用菌培養(yǎng)時，通常采用自然發(fā)酵方法，在自然情況下堆積半年之久，這樣做法的缺點是占用場地、發(fā)酵效果受環(huán)境與個人經(jīng)驗影響較大、產(chǎn)量低，試驗中采用枯草芽孢桿菌活化液加入到桉樹木屑中混合發(fā)酵，去除了自然發(fā)酵法的弊端，發(fā)酵時間縮短的同時，重要的是菌絲生長所需時間縮短，生物轉(zhuǎn)化率也明顯提高。

（2）研究對枯草芽孢桿菌活化菌液加入到桉樹木屑中混合發(fā)酵過程中有機氮（牛糞）與無機氮（尿素）對發(fā)酵產(chǎn)物促進生長的效果進行了探討，發(fā)現(xiàn)特定的發(fā)酵時間下，發(fā)酵過程加入有機氮濃度過高時，菌袋的成品率有所下降；而加入無機氮時菌袋成品率沒有明顯的變化。這一現(xiàn)象的原因可能是有機氮中本身含有一些不利于成品率提高的生物因子（如耐高溫的雜菌、耐高溫的蟲卵），試驗所設(shè)定的發(fā)酵時間沒能將其殺死甚至促進了其繁殖。此外，添加適量的尿素雖然菌絲生長速度較快，但生物轉(zhuǎn)化率提高低于添加牛糞的處理，其原因有待進一步研究。

（3）研究所采用的枯草芽孢桿菌菌液與桉樹木屑共同發(fā)酵的方法為：在桉樹木屑中以60～90 g/kg 的比例加入牛糞，混合均勻后，將枯草芽孢桿菌活化菌劑以7～9 g/kg的比例加入混合物中，混合物加水到含水量60%～65%，建堆后在室溫24℃～28℃的環(huán)境下發(fā)酵10 d。發(fā)酵好的材料培養(yǎng)豬肚菌菇出菇袋的配方為：1 kg 培養(yǎng)料中含桉樹發(fā)酵物825 g、米糠150 g、過磷酸鈣10 g、石膏10 g、石灰5 g。

采用該次研究方法豬肚菇物轉(zhuǎn)化率可達到66%～69%。文中的結(jié)果對桉木加工剩余物木屑在食用菌上的應(yīng)用提供了較好的借鑒，也為林菌業(yè)共同可持續(xù)循環(huán)產(chǎn)業(yè)形成發(fā)展具有重要意義。