煙草NtCAD基因克隆與表達分析

趙利杰，王 中，羅朝鵬，謝小東，張劍鋒，李澤鋒，李 鋒，楊 軍，武明珠

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術開發區楓楊街2號450001

木質素是維管植物細胞壁的主要成分，在植物體內具有增強細胞壁機械強度、運輸水分和礦物質以及抵御病蟲害等作用［1-3］，根據木質素單體的不同可將木質素分為S型、G型和H型3種類型［4］。肉桂醇脫氫酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）是合成木質素的關鍵酶［5］，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的作用下，CAD可催化羥基肉桂醛轉化為羥基肉桂醇，即單木酚醇［6］。木質素的組分和含量在CAD基因的調控下會發生變化［7］。擬南芥AtCAD4和AtCAD52個基因同時突變后，木質素含量下降94%［8］；高粱SbCAD突變體植株中，木質素含量下降15%~25%［9］；松樹LpCAD自然突變體植株中，松柏醛含量增加，木質素含量下降9%［10］；玉米ZmCAD突變體植株中，G和S型木質素含量下降，木質素含量下降20%［11］；楊樹CAD基因通過反義和共抑制法處理后，醛類組分增加，木質素含量不變［12］；苜蓿CAD基因在反義抑制調控下，S型木質素含量下降，木質素含量不變［13］。CAD蛋白結構含有3個保守的結構域，包括Zn離子催化中心［Zn1，GHE（X）2G（X）5G（X）2V］、Zn離子結合位點［Zn2，GD（X）10C（X）2C（X）2（X）7C］和NADP（H）輔酶結合位點［G（X）GGV（L）G］［14-16］。根據CAD核苷酸和蛋白序列的同源性系統發育分析結果，將CAD基因的類型劃分為三類［17］。第一類CAD基因主要存在于裸子植物和被子植物中［18］，又被稱為bona fideCAD，直接參與木質素的合成，第二類和第三類主要是被子植物的CADs基因，在裸子植物中也存在第三類CADs基因［19］。第二類CADs中不同基因的功能具有差異性，除參與木質素合成，還與植物抗逆性密切相關［20］。第三類CADs基因在木質素合成過程中的作用不大，通常在一些非木質化的組織中可檢測到這類酶的活性［21］。

煙草是重要的經濟作物，煙葉中木質素含量與其品質密切相關。木質素類物質含量較高的煙葉，其品質相對較差［22］，主要原因是木質素在燃燒時產生刺激性氣味，掩蓋煙葉的香氣［23-24］。此外，在熱分解時木質素會產生一種能引起澀口感覺并有致癌作用的物質兒茶酚［22,25］。目前關于煙草CAD基因的研究相對較少，本研究中以普通煙草K326的cDNA為模板克隆得到1個NtCAD基因，對其進行生物信息學分析和煙草不同組織的表達模式分析，并分析低溫（4℃）脅迫和脫落酸（Abscisic acid，ABA）處理后該基因的表達情況，旨在揭示NtCAD基因功能，為煙葉品質的提升提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 煙草材料

K326種子用15% NaClO消毒15 min后，用滅菌水反復沖洗5次，播種于無菌的二分之一MS培養基中。幼苗長出4片真葉時，移栽到二分之一MS（無瓊脂）中進行培養，待幼苗長出6片真葉后，選取長勢均勻的幼苗進行低溫（4℃）和10 μmol/L脫落酸（ABA）處理，在0、3、6、12、24 h處理后取樣，每處理取3株幼苗，經液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存備用。

田間試驗在湖南郴州桂陽縣煙草基地進行，供試品種為K326。煙苗長至5片真葉時于清明節前后移栽，選取長勢一致的6株煙草，在盛花期采集幼葉葉片、成熟葉葉片、側根、須根、莖節、莖稈、花蕾及花組織，每個組織采集6份，用于分析NtCAD基因在煙草不同組織中的表達情況。

1.2 煙草總RNA提取和cDNA合成

煙草總RNA用GenePure Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒（北京密碼子生物科技有限公司）提取。用超微量核酸蛋白測定儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］測定RNA的濃度和完整性，RNA反轉錄具體步驟參照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］的說明書。

1.3 煙草NtCAD基因全長克隆

從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載并得到的擬南芥的CAD基因序列，在煙草基因組數據庫（www.tobaccodb.org）中進行Blast比對。利用Primer Premier 6對相似性最高的基因序列設計PCR擴增引物（上游引物：5'-TTTCTGCTCTAAAAC AATCGT-3'，下游引物：5'-AGCCTTGTATAATAGTG AACC-3'）。以煙草幼苗的cDNA為模板進行擴增，PCR反應總體系20 μL（cDNA 2 μL、Taq PCR Starmix 10 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 6 μL）。PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸7 min。

使用質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增得到的PCR產物，用DNA純化試劑盒（北京全式金生物有限公司）對目的片段進行回收，回收得到的產物連接pMD19-T simple vector［寶生物工程（大連）有限公司］并轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞（北京擎科生物科技有限公司），經驗證陽性后，將菌液送至華大生物技術有限公司測序。

1.4 煙草NtCAD蛋白生物信息學分析

ORF（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析煙草NtCAD的基因序列，ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分 析NtCAD蛋 白 的 蛋 白序列，PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測啟動子區順式作用元件，SMART軟 件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析NtCAD蛋白的結構域，Protscale軟件（https://web.expasy.org/protscale/）分析NtCAD蛋白的親水性及疏水性，PSORT軟件（https://www.genscript.com/psort.html）分析NtCAD蛋白的亞細胞定位，PSIPRED軟 件（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預測NtCAD蛋白的二級結構，SWISS-MODEL軟件（http：//swissmodel.expasy.org/）預測NtCAD蛋白的三級結構，使用NCBI Blast在線工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進行CAD核酸和氨基酸序列的同源性比對并下載相關序列，使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法（Neighbor-joining）構建系統發育樹，使用DNAMAN軟件對CAD氨基酸序列進行比對分析。

1.5 煙草NtCAD基因表達分析

以煙草盛花期不同組織和不同條件處理下的cDNA為模板，用qPCR方法分析NtCAD基因的相對表達量。根據NtCAD基因序列設計熒光定量PCR引物（上游：5'-TCTGATGGCAAACCTACCCA A-3'，下游：5'-TTCAATGGGCTGTACACTGTC-3'）。反應總體系20 μL（cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，10 μL qPCR SuperMix，6 μL ddH2O）。反應程序：94℃預變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火20 s，45個循環。每個實驗做3次生物學重復，相對表達量用2-△△CT公式計算［26］。分別以成熟葉葉片和不同處理0 h為對照（表達量設為1），該基因在不同組織或不同處理時間的表達量與對照組的比值為該基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 煙草NtCAD基因克隆

以煙草幼苗cDNA為模板，經PCR擴增，切膠回收，驗證克隆后得到1條單一條帶，長度約為1 200 bp左右的，與預期的PCR產物長度一致（圖1）。測序得到一條全長為1 074 bp的CDS序列，編碼357個氨基酸。

圖1 NtCAD基因的PCR電泳圖Fig.1 PCR electrophoretogram of NtCAD gene

2.2 煙草NtCAD蛋白生物信息學分析

利用NCBI Blastp對克隆得到基因的氨基酸序列進行同源比對，結果顯示其與牽牛花（Ipomoea nil）、咖啡（Coffea arabica）的CAD氨基酸序列相似性分別為86.80%和84.31%，所以將其命名為NtCAD。

利用MEGA 7.0用鄰接法構建NtCAD和其他物種的CAD氨基酸序列系統發育樹（圖2）。結果顯示：NtCAD與辣椒（Capsicum annuum）CaCAD、三 裂 葉 薯（Ipomoea triloba）ItCAD和 牽 牛 花（Ipomoea nil）InCAD的親緣關系最為接近。進化樹顯示NtCAD屬于GroupⅠ（第一類），該類基因直接參與并促進木質素的合成。

圖2 植物CAD同源蛋白的系統發育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of plant CAD homologous proteins

用SMART在線軟件對NtCAD進行蛋白保守結構域檢測，顯示NtCAD具有一個完整的醇脫氫酶結構域和一個輔酶分子結構域。用DNAMAN對煙草NtCAD和其他物種CADs氨基酸序列進行多重比對，結果顯示：不同物種CAD氨基酸序列均存在Zn離子催化位點［Zn1，GHE（X）2G（X）5G（X）2V］、Zn離子結合位點［Zn2，GD（X）10C（X）2C（X）2（X）7C］和NADPH輔酶結合位點即［G（X）GGV（L）］保守的功能結構域（圖3）。說明CAD在不同的物種中，其底物結合位點均具有保守性。

圖3 不同植物CAD蛋白序列的比對Fig.3 Alignment of CAD protein sequences in different plants

分析發現NtCAD預測蛋白分子量為38.99 kDa，等電點為5.54，共有44個氨基酸殘基（Asp+Glu）帶負電荷、35個氨基酸殘基（Arg+Lys）帶正電荷。預測蛋白的不穩定系數為26.87%，表明NtCAD蛋白為穩定性蛋白。其親水最大值為-2.800，疏水最大值為2.433，表明該蛋白為親水性蛋白。預測分析發現該蛋白位于細胞質中。

NtCAD蛋白的二級結構預測結果顯示，其主要由23.81%的α-螺旋、43.14%的不規則卷曲、8.12%的β-轉角和24.93%的延伸鏈構成（圖4）。NtCAD和AtCAD5的氨基酸序列相似性78.65%，以擬南芥AtCAD5蛋白為模板，用SWISS-MODEL對NtCAD蛋白的三級結構進行建模，得到該蛋白的三級結構圖（圖5）。在擬南芥木質素的合成過程中AtCAD4和AtCAD5起關鍵作用［8］，推測NtCAD也具備和AtCAD5相似的功能。

圖4 NtCAD蛋白二級結構預測Fig.4 Secondary structure prediction on NtCAD protein

圖5 NtCAD蛋白三級結構預測Fig.5 Tertiary structure prediction on NtCAD protein

2.3 煙草NtCAD基因表達分析

用實時熒光定量PCR分析煙草盛花期NtCAD基因在不同組織中的表達情況，發現盛花期不同組織中NtCAD基因均有表達，花蕾、側根和須根中NtCAD的表達量較高，葉片（成熟葉）和莖（莖稈、莖節）中的表達量相對較低（圖6）。

圖6 NtCAD基因在煙草盛花期不同組織中的表達Fig.6 Expression of NtCAD gene in different tissues at full-bloom stage of tobacco

通過分析煙草NtCAD基因啟動子序列，發現NtCAD啟動子區域含有參與低溫（LTR）和脫落酸（ABA）應答的順式作用元件。低溫（4℃）處理3 h，NtCAD基因的表達量顯著升高，處理12 hNtCAD基因的表達量最高，和對照比上升了5.04倍（圖7A）。激素ABA處理后，NtCAD基因的表達量呈周期性變化趨勢，3 h表達量較對照值顯著升高，6 h和12 h有所下降，24 h表達量顯著升高，和對照比上升了1.97倍（圖7B）。

圖7 NtCAD基因在不同處理下的表達Fig.7 Expression of NtCAD gene under different treatments

3 討論

從煙草中克隆得到的NtCAD基因CDS長1 074 bp，共編碼357個氨基酸。NtCAD氨基酸序列具有CAD基因保守的結構域，其蛋白三維結構和底物結合位點也具有高度保守性［17］。NtCAD與擬南芥AtCAD4、AtCAD5在進化上屬于同一分支，親緣關系較近，均屬于GroupⅠ類基因［14］，該類CAD基因能夠直接調控木質素的合成［18］。

NtCAD基因在煙草盛花期各個組織中都有表達，但在花蕾和根中的表達量相對較高，在莖和葉片的表達量相對較低。此外，在其他植物中也發現CAD基因存在組織特異性表達的情況，例如擬南芥AtCAD4基因在根中的表達量較高，莖中的表達量相對較低，AtCAD5在木質化程度較高的擬南芥根部具有較高的表達量［20,27］；高粱SbCAD在莖中的表達量較高，葉片中幾乎不表達［28］；馬尾松CAD基因在側枝中表達量最高，根，葉和芽的表達量較低［29］；胡蘿卜DcCAD基因在葉片中的表達量顯著高于葉柄和根［30］，推測與這與CAD基因的功能多樣性有關。

對煙草NtCAD基因啟動子序列進行分析，發現其有響應低溫和ABA處理的順式作用元件。

對煙草幼苗進行低溫和ABA處理，兩種處理均能上調NtCAD基因的表達，說明NtCAD基因可以響應非生物脅迫。丹參SmCAD的表達可以被茉莉酸甲酯（MeJA）誘導［31］；胡蘿卜DcCAD基因在低溫（4℃）處理2 h后，表達量顯著升高［30］；甘薯IbCAD1的表達可被ABA、水楊酸（SA）和MeJA誘導［32］。推測不同的CAD基因，對非生物脅迫的響應不同。

4 結論

從煙草K326中采用基因克隆方法得到NtCAD基因，系統發育以及蛋白結構分析結果顯示其屬于CAD基因GroupⅠ。NtCAD基因的表達具有特異性，在煙草盛花期的花蕾和根中的表達量較高。低溫和ABA處理能夠誘導NtCAD的表達，說明該基因還參與煙草非生物脅迫的應答過程。