自噬相關基因Beclin1、LC3在妊娠期糖尿病患者胎盤組織表達及臨床意義

王洪偉，關紅瓊，王茹，黃曉妹

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是常見的妊娠期并發癥，隨著人們飲食、生活習慣的改變，GDM發病率有上升的趨勢[1]。GDM不僅增加了孕婦發生不良妊娠結局的風險，同時也增加了孕婦妊娠后2型糖尿病和心血管疾病的發病風險[2]。因此，研究與GDM發生有關機制具有重要的意義。自噬廣泛存在于各種生物細胞中，是細胞內物質代謝的重要途徑，參與細胞生長分化、廢物清除及結構重建等多種生理過程。自噬失調與多種疾病的發生發展有關，研究表明，高糖水平可增強絨毛外滋養細胞的自噬[3]。Beclin1、微管相關蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain3，LC3)是編碼自噬相關蛋白的重要基因[4-5]，現檢測GDM患者胎盤組織Beclin1、LC3表達水平，并分析二者與GDM患者一般資料之間的關系，探討自噬在GDM發病機制中的可能作用，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年4月—2021年2月在海南醫學院第二附屬醫院產科行剖宮產的GDM患者95例為研究對象(GDM組)，年齡23～37(29.84±3.58)歲，孕周36～40(38.17±1.83)周。同期選取在醫院行剖宮產的正常妊娠孕婦95例為對照組，年齡21～38(29.27±4.31)歲，孕周36～41(38.62±2.01)周。2組孕婦均為單胎妊娠，年齡及孕周比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準(批號：[2019]倫審核第13號)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 GDM患者參照“妊娠合并糖尿病診治指南(2014)”[6]中關于GDM診斷標準確診。(1)納入標準：①孕前無糖尿病，妊娠期為首次診斷；②既往無不良妊娠史；③臨床資料完整。(2)排除標準：①合并腎病等其他妊娠期并發癥；②患有自身免疫性疾病；③合并甲狀腺、垂體等內分泌疾病。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 臨床資料收集：收集2組孕婦體質量指數(BMI)、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)水平，以及分娩時新生兒體質量等資料。

1.3.2 胎盤樣本處理：孕婦分娩后30 min內獲取胎盤組織，稱取胎盤質量。取胎盤母體面中央組織2 cm×2 cm×2 cm組織塊，生理鹽水漂洗，留取一部分保存至-80 ℃冰箱，其余用4%多聚甲醛固定12 h，梯度酒精脫水30 min，石蠟包埋。

1.3.3 胎盤組織中Beclin1、LC3 mRNA表達檢測：采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測，以RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)對胎盤組織中RNA進行提取，檢測RNA濃度，將提取的RNA反轉錄為cDNA，之后進行qRT-PCR反應，反應條件：預變性 95℃ 5 min，變性 95 ℃ 30 s，退火 60℃ 30 s，共40個循環。以GAPDH為內參基因，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算Beclin1、LC3 mRNA的相對表達量。

表1 胎盤組織中Beclin1、LC3 mRNA引物序列

1.3.4 胎盤組織中Beclin1、LC3蛋白表達檢測：采用免疫組織化學法檢測，石蠟標本進行連續切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫蠟至水，PBS清洗，抗原修復，室溫封閉1 h。加入兔抗人Beclin1、LC3單抗(英國Abcam公司)，4 ℃孵育過夜，加入山羊抗人IgG二抗(英國Abcam公司)(稀釋比1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，加入DAB染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)進行染色，蘇木素復染，酸酒精短暫分化后，脫水、透明、封片。細胞質或細胞核內出現黃色或棕色顆粒為陽性。采用免疫反應積分(IRS)法對染色結果進行半定量評分。陽性細胞百分比評分：無陽性細胞 0分，占比<25%記1分，25%≤占比≤50%記2分，50%<占比≤75%記3分，占比>75%記4分。陽性細胞染色強度評分：無染色0分，淺黃色1分，黃褐色2分，棕褐色3分。IRS=陽性細胞百分比評分×陽性細胞染色強度評分，以IRS≤3分為陰性，IRS>3分為陽性。

1.3.5 妊娠結局：記錄孕婦和胎兒健康狀況，如發生產后出血、羊水過多、胎兒窘迫、巨大兒等為不良妊娠結局。

2 結 果

2.1 2組臨床資料和不良妊娠結局比較 與對照組比較，GDM組年齡、孕周差異無統計學意義(P>0.05)，BMI、FPG、FINS、胎盤質量、新生兒體質量及產后出血、羊水過多、胎兒窘迫、巨大兒發生率均顯著升高(P<0.05),見表2。

表2 GDM組與對照組臨床資料和不良妊娠結局比較

2.2 2組胎盤組織Beclin1、LC3 mRNA表達水平比較 與對照組比較，GDM組胎盤組織Beclin1、LC3 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.01)，見表3。

表3 GDM組與對照組胎盤組織Beclin1、LC3 mRNA表達水平比較

2.3 2組胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達比較 Beclin1、LC3均在細胞膜和細胞質中表達。與對照組比較，GDM組胎盤組織Beclin1、LC3蛋白陽性表達率均顯著升高(P<0.01)，見表4、圖1。

圖1 對照組與GDM組胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達比較(免疫組織化學染色，×200)

表4 GDM組與對照組胎盤組織中Beclin1、LC3蛋白表達比較 [例(%)]

2.4 胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達在GDM患者不同臨床資料和不良妊娠結局中比較 Beclin1及LC3蛋白表達在GDM患者年齡、孕周、BMI比較差異無統計學意義(P>0.05)；Beclin1及LC3蛋白陽性表達GDM患者FPG、FINS、胎盤質量、新生兒體質量及產后出血、羊水過多、胎兒窘迫、巨大兒發生率均高于Beclin1、LC3蛋白陰性表達GDM患者(P<0.05)，見表5。

表5 胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達在GDM患者不同臨床資料和不良妊娠結局中比較

2.5 Logistic回歸分析影響GDM患者發生不良妊娠結局的危險因素 以GDM患者是否發生不良妊娠結局為因變量，排除年齡等混雜因素后，以胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果表明,胎盤組織Beclin1、LC3蛋白陽性表達是GDM患者發生不良妊娠結局的危險因素(P<0.01)，見表6。

表6 Logistic回歸分析影響GDM患者發生不良妊娠結局的危險因素

3 討 論

GDM是指孕婦妊娠期間首次發生或出現糖尿病，影響GDM發生的危險因素包括超重、肥胖、高齡、家族糖尿病史等[7]。正常妊娠過程中，母體會通過一系列的生理變化以滿足胎兒生長的需要，胰島素敏感性降低是重要的代謝適應，在妊娠后期，孕婦處于胰島素抵抗狀態，使血糖稍微升高，促進葡萄糖通過胎盤運輸，促進胎兒的生長[8]。目前主要認為胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙導致的糖耐量受損是引起GDM發生的主要原因[9-10]。本研究結果表明，GDM患者FPG、FINS均顯著高于正常妊娠孕婦。胎盤是母體與胎兒物質交換的主要器官，GDM可導致胎盤細胞功能、血管發生異常，導致胎盤發生病理性變化，從而影響子宮內胎兒的正常生長發育[11]。本研究結果表明，GDM患者胎盤質量、新生兒體質量及產后出血、羊水過多、胎兒窘迫、巨大兒發生率均顯著高于正常妊娠孕婦，提示GDM發生過程中胎盤形成異常，可能會導致不良妊娠結局的發生，具體機制有待深入研究。

自噬是在缺氧、內質網應激、氧化還原應激等狀態下，維持細胞內能量穩態的過程，自噬失調與包括糖尿病在內的代謝性疾病的發生發展有關[12]。Akcora等[13]研究表明，與正常妊娠孕婦比較，子癇前期孕婦自噬活性增加。Tu等[14]研究表明，抑制自噬能夠減輕糖尿病腎病大鼠的胰島素抵抗。Beclin1、LC3蛋白均是自噬的標志性蛋白，Beclin1基因位于人染色體17q21，其編碼的Beclin1蛋白是自噬發生與調控的主要蛋白之一，其通過調節自噬前體的形成，引導相關蛋白定位于自噬體膜，其還可以調節細胞自噬與凋亡之間的平衡[15-16]。LC3定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，與自噬體的形成有關，是表示自噬程度的特異性蛋白[17]。本研究發現，GDM組胎盤組織中自噬基因Beclin1、LC3 mRNA表達水平及蛋白陽性表達率顯著高于對照組，且Beclin1、LC3蛋白陽性表達GDM患者FPG、FINS水平高于陰性表達患者，提示自噬可能與GDM的發生有關，與Li等[18]研究結果相似，猜測是因為高血糖抑制胎盤血管生成，導致GDM患者胎盤組織缺血、缺氧，細胞中活性氧水平增加，激活自噬。正常自噬能夠維持細胞功能和組織結構，而過度自噬會引起內皮細胞損傷，引起胎盤發育異常，導致組織缺血、缺氧、營養缺乏，引發胎盤功能障礙，增加巨大兒等不良妊娠結局發生的風險[19]。Li等[18]研究表明,GDM患者胎盤中白介素-6(IL-6)、IL-8等炎性因子及自噬相關基因7(ATG7)和Beclin1表達顯著升高，胎盤中炎性反應和自噬的發生會增加新生兒感染的風險。進一步分析發現，GDM組胎盤組織中Beclin1、LC3蛋白陽性表達患者胎盤質量、新生兒體質量及不良妊娠結局的發生率均高于Beclin1、LC3蛋白陰性表達患者，提示自噬可能與胎盤異常生長及不良妊娠結局有關。Logistic回歸分析結果表明，胎盤組織Beclin1、LC3蛋白陽性表達是GDM患者發生不良妊娠結局的危險因素，原因可能是高糖水平可能引發胎盤的自噬，導致不良妊娠結局的發生，具體機制有待進一步的研究。

綜上所述，GDM患者胎盤組織中自噬基因Beclin1、LC3表達顯著升高，胎盤組織中Beclin1、LC3蛋白陽性表達是GDM患者發生不良妊娠結局的危險因素，自噬可能與GDM的發生及不良妊娠結局有關。由于本研究僅從臨床水平上分析了胎盤組織中Beclin1、LC3的表達情況，下一步還需結合體外實驗進一步探討自噬在GDM發生發展中的可能機制。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

王洪偉：設計研究方案，課題設計，實施研究過程，論文撰寫；關紅瓊：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；王茹：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；黃曉妹：進行統計學分析