基于膠原-瓊脂糖的組織工程表皮替代物構建研究

趙雅靜，曹燕燕，2，申治中，菅傲群，桑勝波

(1.太原理工大學 a.信息與計算機學院 微納系統研究中心，b.新型傳感器與智能控制教育部和山西省重點實驗室，太原 030024；2.河北北方學院 信息科學與工程學院，河北 張家口 075000)

皮膚是人體面積最大的器官，也是人體抵御外部刺激的第一道防線[1]。體外皮膚損傷(如燒傷、凍傷等)，各種皮膚病或其他疾病會導致皮膚大面積損傷，治療需要大量的皮膚源[2-4]。此外，對于許多疾病的研究以及藥物的藥理試驗、化學合成物的毒理試驗都需要用到皮膚樣品，盡管現在動物皮膚在一定程度上可以作為人體皮膚的替代品，但與人體皮膚仍存在差異[5-7]。基于對皮膚的大量需求和倫理等各方面的考慮，開發用于皮膚再生的組織工程具有很大的科學研究和臨床價值[8-9]。

表皮作為人體皮膚的最外層結構，能有效地防止有害物質入侵人體[10]。因此，人們對體外表皮替代物從生物材料、種子細胞等方面進行了大量的研究。在20世紀70年代，有研究者通過對表皮細胞直接進行培養用于創傷治療，但這種方法耗時長、創面接受率低，不利于傷口愈合[11]。因而，人們開始用天然的生物材料與細胞結合進行體外表皮替代物的構建。HORCH et al[12]將角質形成細胞接種在膠原膜上形成單層表皮替代物，但無法在體外維持較長時間。之后，人們相繼使用殼聚糖、明膠、瓊脂糖等生物材料構建表皮替代物，但其生物相容性均低于膠原。因此，選用復合型生物材料更有利于表皮替代物的構建[13]。

膠原是人體皮膚的主要組成成分，維持著人類皮膚的彈性和韌性，同時具有支撐和保護作用，而且主動參與細胞的遷移、分化和增殖代謝，具有良好的生物相容性[14]。在皮膚組織工程方面已經有了大量的應用與研究，但其存在降解速度較快，機械性能較弱的問題[15-16]。瓊脂糖作為一種天然多糖材料，是一種高親水性聚合物，具有細胞無毒性、降解緩慢、材料成本低等特點，成膠后具有良好的機械性能[17-18]。同時，人類永生化表皮(HaCaT)細胞作為體外表皮替代物研究的種子細胞與正常人表皮細胞特性相似，與正常人表皮細胞相比更容易進行繁殖，能更方便地用于實驗研究[19-21]。因此，可以利用瓊脂糖來提高膠原蛋白的機械性能，HaCaT細胞作為種子細胞來構建一種理想的組織工程表皮替代物。

本研究將制備膠原-瓊脂糖的復合水凝膠作為人類永生化表皮(HaCaT)細胞的體外三維生長環境，并對制備的膠原-瓊脂糖復合水凝膠進行體外表征，研究其形貌、理化性能和機械性能，并對HaCaT細胞在其上的生長狀況進行測試。

1 實驗

1.1 樣品制備

將4 mg/mL的鼠尾Ⅰ型膠原蛋白(collagen from rat tail，Type Ⅰ)酸性溶液在冰上用中和液(0.1 mol/L的NaOH溶液)中和至中性并稀釋至2 mg/mL，在4 ℃條件下保存備用。瓊脂糖(麥克林，上海)溶于95 ℃的去離子水中制得質量分數為2%的澄清透明溶液，使其在室溫下溫度降至37 ℃，此時將準備好的膠原蛋白溶液和瓊脂糖溶液按不同比例進行混合(兩者混合后的比例見表1)，混合后的溶液在室溫下靜置凝固，制得膠原-瓊脂糖復合水凝膠。

表1 膠原和瓊脂糖的混合比例Table 1 Ratio of collagen to agarose %

1.2 膠原-瓊脂糖復合水凝膠的性能測試

1.2.1溶脹率的測試

將膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架浸入37 ℃的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)中，24 h后擦干表面多余的水分，測定此時支架的濕重W1，根據公式(1)計算出支架的溶脹率。

Ws=[(W1-W0)/W0]×100% .

(1)

其中，W0為支架浸泡之前的重量[22]。

1.2.2密度的測試

測量膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的重量(W)、半徑(R)和高度(H)，根據公式(2)來計算支架的密度[23]。

(2)

1.2.3降解率的測試

將膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架置于PBS溶液中，放置在37 ℃下，不攪拌。每隔一段時間取出樣品，烘干后稱量，同時用新鮮PBS代替原來的PBS溶液。根據公式(3)計算支架的降解率。

Dd=((WI-WF)/WI)×100% .

(3)

式中：Dd是降解程度；WI是樣品初始干重；WF是最后的樣品干重。

1.2.4機械性能的測試

通過機械試驗機測定膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的彈性模量，在室溫下，以0.5 mm/min的恒定變形速率壓縮樣品。采用變形5%～20%時的應力-應變曲線的斜率來計算彈性模量，結果為7個膠原-瓊脂糖復合水凝膠樣品的平均值。

1.2.5支架形貌分析

在12～15 kV加速電壓下，用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)分析膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的形貌。在掃描電鏡觀察之前將膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架冷凍干燥并進行噴金。

1.2.6活/死細胞實驗

將制備好的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架用細胞培養液(Gibco高糖培養基DMEM加體積分數10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素溶液)浸泡2 h，同時用紫外光照射進行滅菌。得到無菌的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架后，將培養至第三代的HaCaT細胞(購自廣州優澤生物技術有限公司)以1×105cm-2的密度接種在膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的表面，置于培養箱中，3 d后進行活/死細胞染色。先將膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架上的細胞用PBS洗滌兩次，加入活細胞染色試劑(Calcein-AM)染色0.5 h，然后將活細胞試劑吸出后加入死細胞染色試劑(PI)染色3 min，染色完成后對細胞用PBS進行清洗，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7細胞骨架實驗

對接種到支架上的細胞進行鬼筆環肽(Phalliodin)染色，觀察細胞的骨架。與活/死細胞實驗接種細胞過程相同，細胞在膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架上培養3 d后進行鬼筆環肽染色。將支架上的細胞用PBS清洗后加體積分數4%的多聚甲醛固定20 min，然后在避光條件下加入染色試劑，室溫下孵育30 min，用PBS清洗后加入DAPI試劑避光孵育10 min，最后用PBS清洗干凈，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果與討論

2.1 膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架形貌分析

為觀察膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的形貌，對制備的支架冷凍干燥后進行了掃描電子顯微鏡測試，觀察了膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的表面和內部(圖1).圖1中膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架干燥后表面是完整的結構，為細胞的生長提供支撐。冷凍干燥后的膠原-瓊脂糖復合水凝膠內部呈現多孔形態，表明膠原-瓊脂糖復合水凝膠的內部是多孔結構，能為細胞存儲營養物質以及向外界傳遞細胞產生的代謝物，有利于細胞的生長。從SEM的整體結果來看，膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架無論是其表面的完整結構還是內部的多孔結構都有利于HaCaT細胞在其上面的生長，有利于進一步進行表皮替代物的構建與研究。

圖1 膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架表面和內部SEM圖Fig.1 SEM images of the surface and interior of collagen-agarose composite hydrogel scaffold

2.2 膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的理化性能分析

為研究膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的理化性能，對支架進行了密度、溶脹率、降解率的測試(圖2)。由圖2(a)可以發現，瓊脂糖的比例增大，支架的密度增大，這是因為質量濃度為2 mg/mL的膠原溶液密度小于質量分數為2%的瓊脂糖溶液，將兩種溶液以不同比例混合成膠后密度會有所差別。總體來看，不同比例的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的密度都在0.8～1 g/cm3之間，存在較小的差異。但隨著瓊脂糖比例的增大，膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的水溶脹差異明顯(圖2(b)).瓊脂糖比例為0時的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的溶脹率只有7%，而瓊脂糖比例達50%時，支架溶脹率達48%.這種差異的產生是因為相比膠原而言，瓊脂糖具有更強的吸水性，作為細胞支架能為細胞提供更多的水分。膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的降解速率直接影響著細胞可以在支架上生長的時間，圖2(c)是膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架降解率的測試結果。隨著時間的增加，不同比例的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架都有一定程度的降解，但瓊脂糖占比越高，降解的速率越慢。在圖2(c)中，含有瓊脂糖的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架大約留有60%，而瓊脂糖含量為0的支架只有不到35%.因而，含有瓊脂糖的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的理化性能更好。

圖中**表示P<0.01有顯著的統計學差異圖2 膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的密度、溶脹率和降解率Fig.2 Density, swelling rate, and degradation rate of collagen-agarose composite hydrogel scaffold

2.3 膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的機械性能分析

為研究膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的機械性能，對不同比例的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架進行了彈性模量測試(圖3).圖3(a)為不同比例膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的應力-應變曲線圖?？梢园l現，壓縮量一定時，瓊脂糖比例越高，膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的應力越大。而且，與瓊脂糖比例為0的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架相比，比例為20%的膠原-瓊脂糖復合水凝膠是它的2倍；當膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架中瓊脂糖的比例增大到50%時，膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的應力是瓊脂糖比例為0的13倍。由圖3(b)可以發現，瓊脂糖的比例越大，膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的彈性模量越大，在瓊脂糖的比例達到50%時，膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的彈性模量明顯增大。

圖中**表示P<0.01有顯著的統計學差異圖3 膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的應力-應變曲線和彈性模量Fig.3 Stress-strain curve and elasticity modulus of collagen-agarose composite hydrogel scaffold

2.4 膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的生物相容性分析

為了研究膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架的生物相容性，將細胞接種在支架上3 d后對細胞進行了活/死染色(圖4)和鬼筆環肽染色(圖5).由圖4可以觀察得到，隨著瓊脂糖比例的增大，支架上細胞密度無明顯差異，這說明不同比例的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架都比較適合HaCaT細胞的生長。但從死細胞的圖中觀察發現瓊脂糖比例越高，膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架上的死細胞越多。對細胞活性而言，瓊脂糖含量為0的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架最適合HaCaT細胞生長。如圖5所示，對膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架上的細胞進行了鬼筆環肽染色，圖中綠色熒光代表細胞骨架，藍色熒光代表細胞核。在圖中可以觀察到細胞呈方形，部分細胞有分化的趨勢呈現出三角形，在不同比例的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架上可以看到HaCaT細胞的分裂。圖5中瓊脂糖比例為0的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架上的細胞密度最大，可以明顯觀察到細胞的重疊，HaCaT細胞的生長狀況最好。從細胞的增殖分化來看，瓊脂糖比例為0的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架最適合HaCaT細胞的生長。但對于體外表皮替代物的構建，支架在理化與機械方面性能的優劣也影響著表皮替代物的性能。瓊脂糖比例為35%的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架相比含量為0的支架具有更好的機械性能，在圖5中也表現出較好的生物相容性，因此，瓊脂糖含量為35%的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架更適合作為表皮替代物。

圖中綠色熒光代表活細胞，紅色熒光代表死細胞圖4 膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架上細胞的活/死染色圖Fig.4 Live/dead staining image of cells on collagen-agarose composite hydrogel scaffold

圖中綠色熒光代表細胞骨架，藍色熒光代表細胞核圖5 膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架上細胞的鬼筆環肽染色圖Fig.5 Phalloidin staining image of cells on collagen-agarose composite hydrogel scaffold

3 結論

通過制備不同比例的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架，研究其形貌、理化性能、機械性能以及體外的生物相容性發現，當膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架中兩者的含量分別為65%和35%時，支架具有良好的理化性能和機械性能。同時，HaCaT細胞在此比例下的膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架上可以進行良好的生長。因而，在膠原-瓊脂糖復合水凝膠支架中兩者的含量分別為65%和35%時，能夠同時兼顧支架的機械性能和生物相容性，可以作為一種理想的組織工程表皮替代物。