牽正散合大補陰丸對蛋白酶抑制因子I誘導的帕金森病體外細胞模型大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞的增殖和凋亡的影響

黃松麗 張琳婧 張秋艷 王媛媛 梁羽茜 胡秀華

帕金森病是一種中樞神經性疾病，神經元的丟失與該病的發生發展密切相關。中醫藥可能通過針對不同致病因素的多重作用保護存活的多巴胺神經元[1]。牽正散和大補陰丸是中醫臨床常用的兩個方劑，柴原等[2]研究表明牽正散和大補陰丸及其合方對小鼠腦神經有保護作用。此外，課題組前期研究發現6 μmol/L蛋白酶抑制因子I(proteasome inhibitor I，PSI)誘導大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞可成功復制帕金森病體外細胞模型，而一定濃度的牽正散水煎劑能夠改善PSI對該細胞的抑制作用[3]。本研究通過PSI對大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(pheochromocy-toma cells，PC12)進行誘導，復制帕金森病體外細胞模型，研究牽正散合大補陰丸水煎劑對該細胞模型細胞增殖、凋亡及總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量的影響，檢測牽正散合大補陰丸水煎劑對泛素/蛋白酶體途徑中相關因子TBP1-19和PA28α蛋白表達的影響，確定牽正散合大補陰丸對帕金森病體外細胞模型的影響及作用機制，為中醫臨床治療提供新思路和可靠依據，并為合方用藥提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株

大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(pheochromocy-toma cells，PC12)，編號：3111C0001CCC000024，購于北京協和醫學院基礎學院細胞中心。該細胞為疏松貼壁細胞，以多角形為其形態特性，85% RPMI 1640和10% 胎牛血清以及5%馬血清的完全培養基為其培養條件，于恒溫恒濕(37℃，5%CO2)培養箱中培養。

1.2 藥物制備

PSI(德國默克集團，批號：539160)粉末溶于DMSO中，配制為2 mmol/L的儲存濃度，于-20℃冰箱避光分裝保存。

大補陰丸、牽正散兩方劑藥物購于北京同仁堂藥業有限公司。依據常規煎煮方式將大補陰丸(熟地黃18 g、龜板18 g、黃柏12 g、知母12 g)水煎濃縮并經過無菌處理，以2 g/mL的水煎劑濃度4℃冰箱中保存備用(長期則保存于-20℃冰箱)。牽正散(白附子9 g、白僵蠶9 g、全蝎9 g)水煎劑的制備方式和儲存濃度與之相同[3]。

1.3 主要試劑

Annexin-FITC/PI雙染試劑盒(江蘇凱基生物科技有限公司，批號：KGA106)，SOD檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號：R22261)，TBP1-19(美國Enzo公司，批號：03051248)，PMSE1多克隆抗體(又名：PA28α，美國PROTEINTECH GROUP公司，批號：10543-1-AP)，β-actin(美國PROTEINTECH GROUP公司，批號：20536-1-AP)，羊抗小鼠IgG-HRP(北京索萊寶生物科技有限公司，批號：SE131)，羊抗兔IgG-HRP(北京索萊寶生物科技有限公司，批號：SE134)。

1.4 分組處理

根據MTT法計算出對PC12細胞抑制率為0%、25%(即IC0、IC25)時的牽正散水煎劑的濃度分別為0.20 mg/mL(下文為Q0)、12.29 mg/mL(下文為Q25)，大補陰丸水煎劑的濃度分別為0.81 mg/mL(下文為D0)、4.49 mg/mL(下文為D25)。據此將實驗分組設置為9組：模型組；模型加單方組分為PSI+Q0組，PSI+Q25組和PSI+D0組，PSI+D25組；PSI加合方組分為P+D25+Q25組，P+D25+Q0組和P+Q25+D0組；空白對照組。模型組給藥為6 μmol/L PSI[4]，PSI加藥組即6 μmol/L PSI及上述各組對應濃度藥物共同處理，空白對照組予等量培養液培養。每組設三個平行樣本。

1.5 流式細胞術檢測凋亡

將PC12細胞按每孔6×104個/mL的密度接種于6孔細胞培養板中，培養24小時后按照1.4分組及給藥處理，繼續培養48小時，將懸浮在培養液中的PC12細胞收集于離心管中離心(2 000 r/min，5分鐘)后加入預冷的PBS吹打混勻；用不含EDTA的胰酶將貼壁生長的PC12細胞消化收集于離心管中離心，加入預冷的PBS吹打混勻；將兩離心管中的細胞混合，重懸離心后用PBS洗滌一次。用500 μL Binding buffer吹打混勻PC12細胞后，避光加入5 μL Annexin-FITC混勻，再加入5 μL Propidium Iodide，室溫避光環境下放置10分鐘后進行流式細胞儀檢測。

1.6 NBT核黃素比色法檢測細胞上清液SOD含量

細胞培養、接種方式、分組及給藥處理均同1.5，各組細胞繼續培養48小時，保留細胞上清液儲存于-20℃冰箱備用。設置分組，根據說明制備工作液，于EP管中加入各組分混勻，隨后光照對照組和待測樣品組分別加入96孔板中。將空白對照組EP管單獨置于暗處避光反應；96孔板暴露在4 000 LX日光燈下反應20分鐘后，將空白對照組移至96孔板，酶標儀讀出560 nm處吸光度，根據吸光度計算各樣品組SOD含量。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測牽正散合大補陰丸水煎劑對泛素/蛋白酶體途徑中相關因子表達的影響

以2×105個/mL的密度將對數生長期的PC12細胞傳至25 cm2細胞培養瓶中，培養24小時后分組及給藥處理方式同1.4，繼續培養48小時。用RIPA裂解收集貼壁細胞的蛋白，取少量稀釋后測定蛋白濃度，并將其余蛋白進行變性。配制12%分離膠和濃縮膠，制膠后將各組樣品加入上樣孔中進行電泳，待各蛋白組分分離明顯時用PVDF膜覆蓋于SDS-PAGE膠上進行電轉，隨后將PVDF膜移至孵育盒中，用5%的脫脂奶粉室溫條件下封閉2小時，加入一抗4℃孵育過夜，第二天加入二抗室溫孵育1小時，TBST洗膜三次后，避光滴加發光液，曝光機中曝光掃描。使用Image J軟件分析所得目的蛋白條帶。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 牽正散合大補陰丸水煎劑對PSI誘導的PC12細胞模型凋亡的影響

與空白對照組相比，模型組及模型加藥組壞死細胞百分比、凋亡細胞百分比不同程度升高，正常細胞百分比不同程度降低。與模型組相比，P+Q0組、P+Q25組及P+Q25+D0組壞死細胞、凋亡細胞百分比下降，正常細胞百分比增加。如表1及圖1所示。

表1 牽正散合大補陰丸水煎劑對PSI誘導的PC12細胞模型凋亡的影響

圖1 牽正散合大補陰丸水煎劑對PSI誘導的PC12細胞模型凋亡的影響

2.2 牽正散合大補陰丸水煎劑對PSI誘導的PC12細胞模型上清液SOD活力檢測

與空白對照組相比，模型組SOD活力值降低(P<0.05)；與模型組相比，除P+Q0組外，6個模型加藥組SOD活力值均提高(P<0.05)。如表2所示。

表2 牽正散合大補陰丸水煎劑對PSI誘導的PC12細胞模型上清液中SOD活力的影響

2.3 牽正散合大補陰丸水煎劑對PSI誘導的PC12細胞模型TBP1-19蛋白表達水平的影響

與空白對照組相比，模型組TBP1-19蛋白表達水平降低；加藥組的TBP1-19蛋白表達量較模型組高，其中P+Q0組、P+Q25+D0組和P+D25+Q25組的TBP1-19蛋白表達水平明顯高于模型組。由此可見，PSI誘導PC12細胞后可下調TBP1-19蛋白水平的表達；牽正散和大補陰丸水煎劑兩方合用對PSI誘導后PC12細胞中TBP1-19蛋白表達的下降有明顯改善作用。 如圖2、圖3所示。

圖2 牽正散及牽正散合大補陰丸水煎劑對PSI誘導的PC12細胞模型TBP1-19蛋白表達的影響

圖3 大補陰丸及牽正散合大補陰丸水煎劑對PSI誘導的PC12細胞模型TBP1-19蛋白表達的影響

2.4 牽正散合大補陰丸水煎劑對PSI誘導的PC12細胞模型PA28α蛋白表達水平的影響

蛋白免疫印跡法檢測PA28α蛋白表達水平結果如圖4、圖5所示，模型組與空白對照組相比PA28α蛋白表達水平降低；各模型加藥組與模型組相比，P+Q0組、P+Q25+D0組的PA28α蛋白表達水平升高。由此可知，PSI誘導PC12細胞后，可下調PA28α蛋白的表達；牽正散和大補陰丸及其合方水煎劑可明顯提高PSI誘導后PC12細胞模型中PA28α蛋白的表達。

圖4 牽正散及牽正散合大補陰丸水煎劑對PSI誘導的PC12細胞模型PA28α蛋白表達的影響

圖5 大補陰丸及牽正散合大補陰丸水煎劑對PSI誘導的PC12細胞模型PA28α蛋白表達的影響

3 討論

中醫學認為帕金森病屬于“顫證”范疇，該病多以肝腎陰虛、氣血不足為本，以風、痰、瘀、火為標[4]。帕金森病的中醫臨床治療以熄風止顫為主，以補益肝腎、益氣養血、清熱祛痰及活血化瘀為輔[5]。《黃帝內經素問》 指出“諸風掉眩，皆屬于肝”，而明代王肯堂在《證治準繩》中提出該病病機為“老年陰血不足，少水不能治盛火”，說明該病與肝風及陰虛火旺關系密切。牽正散與大補陰丸是經典的中醫方劑，前者熄風止顫，后者補益肝腎，與本病治法相符。現代藥理學研究指出，牽正散具有抗腫瘤、抗炎、鎮靜、抗驚厥作用[6-8]。大補陰丸組成藥物的活性成分對神經系統在內的多個系統具有廣泛藥理作用[9-10]，其中龜板也具有保護神經的作用[11]。

目前應用PSI誘導PC12細胞是構建帕金森病體外細胞模型的常用方法，PSI作用24小時后，PC12細胞內可形成典型帕金森病特征[12]。而細胞凋亡在帕金森神經元損傷與丟失過程中起了重要作用[13]，熒光染色后，流式細胞儀檢測可將凋亡、壞死以及正常細胞區分出來。檢測發現各組不同濃度的藥物作用于PC12細胞模型48小時后，模型組與空白對照組相比顯示出PSI處理后PC12細胞壞死、凋亡比例升高，而加藥組與模型組相比則均有不同程度降低細胞壞死和凋亡的作用，其中P+Q25+D0組及P+Q0組、P+Q25組效果較好。此外，抑制氧化應激反應是中醫藥治療帕金森病相關作用機制之一[13]。SOD是生物體內氧化應激過程中一種重要的抗氧化酶，其活力升高能夠消除或減輕氧自由基造成的傷害，保護機體。結果顯示，模型組PC12細胞經PSI誘導后SOD較空白對照組活性下降，不同濃度的牽正散合大補陰丸水煎劑干預后，與模型組相比可使SOD值升高，達到緩解PSI造成的損傷、發揮保護細胞的作用。

帕金森病以中腦黑質中多巴胺神經元損傷、路易小體形成為病理特征，泛素是路易小體的成分之一，因此，泛素/蛋白酶體途徑可能是帕金森病發病的相關通路。泛素/蛋白酶體途徑與蛋白質代謝和功能緊密相關，是生物體內細胞蛋白降解系統的重要途徑，TBP1-19、PA28α是該通路中的重要靶點，參與調節蛋白質降解。泛素/蛋白酶體途徑中的FBXO7和Parkin兩種蛋白與帕金森病發病有關，且有研究表明帕金森病患者發生黑質20S蛋白酶體的α2亞基以及激活亞基TBP1-19、PA28蛋白丟失[14-15]。經研究發現牽正散合大補陰丸水煎劑對泛素/蛋白酶體途徑中的相關因子TBP1-19、PA28α蛋白的表達均有影響，且不同濃度的牽正散合大補陰丸水煎劑均可以改善PSI誘導的PC12細胞模型中的TBP1-19及PA28ɑ蛋白表達水平。

綜上所述，不同濃度的牽正散合大補陰丸水煎劑可在不同程度上改善PSI誘導的PC12細胞模型壞死及凋亡情況，改善PSI誘導細胞模型中的SOD降低，提高TBP1-19、PA28α蛋白表達水平。體外實驗驗證了牽正散合大補陰丸水煎劑對帕金森病具有一定的保護作用，與柴原等人進行的小鼠體內實驗結果一致[2]，這為臨床治療帕金森病提供了新思路。