蝙蝠攜帶病毒機制的研究概況和進展①

周 浩 馬 龍 姚新生 （遵義醫科大學免疫學教研室，貴州省高校免疫分子工程中心，遵義563000）

1 蝙蝠攜帶病毒概況

蝙蝠是哺乳綱翼手目動物，世界范圍內存在的蝙蝠約1 240 種，占現存哺乳動物種類的20%以上，是僅次于嚙齒目動物的第二大類哺乳動物，是唯一一類具有飛行能力的哺乳動物，除極地和大洋洲部分島嶼外，遍布于全世界，是除人類外分布范圍最廣的哺乳動物類群，熱帶和亞熱帶分布最多［1-2］；蝙蝠既可棲息于自然環境，也可寄居于人造環境，由于其飛行能力，蝙蝠與人類接觸十分密切，廣泛的分布及其與人類的高接觸率有助于蝙蝠體內攜帶病毒在人群中傳播。

近年埃博拉、西尼羅河熱、嚴重急性呼吸道綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和高致病性禽流感等一系列突發公共衛生事件表明，以野生動物為宿主的人畜共患病毒不僅威脅野生動物自身生存，且嚴重威脅人類健康［3-7］。對1940~2004 年全球335 例新發傳染病病例進行分析發現，60.3%新發傳染病病例由人畜共患病毒引起，其中71.8%病原體來自野生動物［8］。既往研究普遍認為靈長類和嚙齒類是攜帶及傳播人畜共患病毒的主要宿主，但對世界范圍內各物種攜帶病毒豐度研究發現，蝙蝠攜帶病毒比例位居哺乳動物榜首［9］。

既往大部分蝙蝠和病毒研究集中于狂犬病毒與其他彈狀病毒科病毒，1911 年首次在吸血蝠中發現了狂犬病毒，隨后發現狂犬病毒與多種蝙蝠均有聯系［10］。研究表明，除莫科拉病毒外，其他狂犬病病毒均以蝙蝠為其自然宿主，感染陸生食肉動物的所有狂犬病病毒均由蝙蝠相關狂犬病病毒跨物種傳播，人類由于蝙蝠-狂犬病病毒感染導致死亡的案例在美洲、歐洲、澳大利亞和非洲均時有發生［11-13］。近年在人體和蝙蝠中發現多種新型病毒，如1990年澳大利亞和馬來西亞爆發的亨德拉病毒和尼帕病毒對嚴重威脅人類生命，而狐蝠是這兩種烈性病毒的主要宿主［14-15］。在中國廣東和香港兩地由冠狀病毒引發的SARS 也導致了嚴重后果，隨后在蝙蝠體內分離或發現了馬爾堡病毒、坎帕耳病毒、馬六甲病毒等100 余種病毒，大部分為RNA 病毒，關于蝙蝠體內攜帶DNA 病毒的報道較少。2008 年首次從日本果蝠中分離出第一株蝙蝠腺病毒［16］；2010 年中國石正麗課題組采用大衛鼠耳蝠腎原代細胞分離出新的蝙蝠腺病毒BtAdv-TJM，并對其基因組及潛在宿主范圍進行了全面研究［17］。蝙蝠體內攜帶多種烈性病毒，其病毒傳播方式備受關注。多項證據表明，單峰駝在中東呼吸道綜合征（middle east re‐spiratory syndrome，MERS）冠狀病毒傳播中可能作為中間宿主，但鑒于MERS 冠狀病毒與其他蝙蝠來源冠狀病毒（如Bat CoV HKU4、HKU5、中東、非洲、歐洲及亞洲分離鑒定的病毒）在進化上關系密切，因此普遍認為蝙蝠是MERS 冠狀病毒的自然宿主［18-21］。ZHENG 等［2］分別對 4 個地區的 6 種蝙蝠糞便樣本進行病毒宏基因組學分析，發現蝙蝠中存在的甲型流感病毒和冠狀病毒與人類高度相似，表明可能存在跨物種傳播。2013年，GE 等［6］從云南省中華菊頭蝠糞便樣本中分離獲得一株活的SARS 樣冠狀病毒，是目前SARS冠狀病毒來源于蝙蝠的最強證據，且研究結果證明SARS冠狀病毒在跨物種感染中無需中間宿主。

近年研究者已逐漸認識到蝙蝠在攜帶及傳播病毒方面的重要公共衛生意義，開始關注蝙蝠本身、蝙蝠病毒及其攜帶病毒的機制［22-23］。蝙蝠物種的多樣性和部分獨特的生物特征使其成為多種病毒的天然宿主［24］。蝙蝠攜帶多種病毒，但實驗感染和自然感染的蝙蝠鮮有病毒感染導致的死亡發生，鮮有攜帶病毒導致蝙蝠嚴重損傷的報道，因此蝙蝠抗病毒機制研究備受關注，目前蝙蝠抗病毒機制大致可分為生理因素、免疫因素及待探索機制［25］。蝙蝠免疫相關研究及抗病毒可能機制見表1。

表1 蝙蝠免疫系統及抗病毒機制相關研究進展Tab.1 Research progress on immune system and anti-viral mechanism of bats

2 蝙蝠生理性抗病毒機制

蝙蝠是具有飛行功能的哺乳動物，其飛行能力可能在抗病毒過程中起重要作用。多種蝙蝠在季節性遷徙時會進行長距離飛行，如鼠耳蝠會從冬眠地點遷徙200~400 英里，墨西哥無尾蝙蝠在得克薩斯州和新墨西哥州越冬地點遷徙至少800 英里［10］。蝙蝠長時間飛行過程中的高代謝需求可導致體溫升高至 40℃ 左右［23］。CANALE 和 HENRY 提出高溫將阻止病毒復制，提高免疫應答效率［26］；多種動物體溫升高與降低與疾病持續時間和存活率相關。體溫達到類似哺乳動物發燒過程中，哺乳動物核心體溫維持在 38℃~41℃［10，27］。高體溫增強免疫應答頻率，包括固有免疫和適應性免疫系統組成，如增加干擾素生成、增強輔助性T 細胞表達及細胞毒活動、增強抗體生成、自然殺傷細胞補體活動，因此部分學者認為極高體溫可能導致蝙蝠在感染早期抵御部分病原體。

部分溫帶蝙蝠的重要特征是其蟄眠和冬眠能力，夏天或氣溫較高時進入短暫日蟄眠而在冬季進入季節性冬眠狀態，冬眠或蟄眠時的免疫狀態變化備受關注。其他哺乳動物研究表明，冬眠可同時影響先天和獲得性免疫系統。研究認為，蝙蝠免疫功能在休眠期間減弱，冬眠期間免疫能力被顯著抑制，在宿主能量保存方面起重要作用［10］。同時，多數病毒在低溫下無法充分復制，感染機會較小。

3 蝙蝠免疫系統組成和抗病毒機制

3.1 蝙蝠免疫系統組成 免疫系統包含固有免疫系統和適應性免疫系統，在生理結構上，蝙蝠是典型的哺乳動物，具有骨髓、胸腺、脾臟和淋巴結等免疫器官。最近對蝙蝠脾臟結構深入研究發現其含有白髓、紅髓等結構，生發中心結構也與哺乳動物類似［28］。雖然目前沒有專門用于蝙蝠特異型細胞檢測的試劑，但形態和物理化學法證明蝙蝠體內細胞群體與哺乳動物類似［29］。采用掃描電鏡和分子黏附性質在印度果蝠脾臟和淋巴結中分離出T、B淋巴細胞和巨噬細胞，并證實其巨噬細胞/B細胞/T細胞比例為1∶2∶9，與小鼠巨噬細胞/B 細胞/T 細胞比例類似（1∶1∶8）。此外，TURMELLE 等［30］通過注射T細胞有絲分裂原PHA 發現，多種免疫細胞，包括淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞及巨噬細胞存在于巴西無尾蝙蝠。SARKAR等［31］在果蝠中檢測到濾泡樹突狀細胞（follicular dendritic cells，FDCs），而FDCs 在提呈抗原及誘導維持記憶性免疫應答方面具有重要作用，并有證據證實部分病毒在與FDCs 復合時可保持傳染性，但FDCs 是否在蝙蝠抗病毒感染中發揮作用需進一步研究。目前對蝙蝠細胞亞群的檢測較少，已知細胞亞群形態特征及功能也有待在其他種類蝙蝠中進一步考證。近年蝙蝠基因組研究日益廣泛，包括對埃及果蝠、馬來大狐蝠、大衛鼠耳蝠等十幾種蝙蝠均進行了宏基因組測序，隨著測序技術進步，得到的蝙蝠基因組也越來越完整，雖然在部分免疫應答基因上發生了擴增及壓縮，但就目前各種蝙蝠的相關信息來看，蝙蝠無論是在器官構造、細胞集群及主要抗病毒基因家族上均與普通哺乳動物無顯著差別［32-33］。因此需進一步研究其免疫系統以闡明蝙蝠無癥狀攜帶病毒的機制。

3.2 蝙蝠固有免疫系統與抗病毒應答 固有免疫可通過模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）識別病原微生物部分保守成分，即病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）激活受體特異性信號轉導通路，產生非特異性抗病原微生物反應，包括Toll 樣受體（Toll-like re‐ceptors，TLRs）及RLHs 均在抗感染第一道防線中發揮重要作用，而RIG-1-IFN-STAT-1 信號通路對細胞抗病毒產生重要影響。目前蝙蝠固有免疫研究已取得顯著進展，研究者猜測蝙蝠可無癥狀攜帶病毒的可能原因是蝙蝠能夠在病毒感染早期快速應答，通過特定固有免疫抗病毒機制抑制病毒復制［34］。狐蝠和果蝠中發現在其他哺乳動物中高度保守的TLRs，并對狐蝠中發現的TLRs 進行定量組織表達分析，發現TLRs1~10 與人類同源，另外還有1 個完整的TLR13 假基因，目前僅在嚙齒類動物中存在TLR13，而TLR13 敲除小鼠對水泡性口炎病毒更為敏感；此外野生中國馬蹄蝠中發現的RIG-1和IFN-β與人、小鼠、豬及恒河猴具高度同源，而RIG-1 可檢測細胞質中的病毒核糖核酸，并產生Ⅰ型干擾素控制病毒感染［35-38］。病毒感染后最早的免疫反應之一是產生干擾素，Ⅰ型干擾素是最重要的抗病毒免疫因子之一［39］。2015年研究者首次在體外證明IFN-β在大衛鼠耳蝠中的抗病毒活性，而PAVLOVICH 發現埃及果蝠的Ⅰ型干擾素家族明顯擴增，而其攜帶46 種Ⅰ型干擾素基因數是狐蝠的2 倍，主要的擴增家族是IFN-ω 家族；隨后的體外實驗中用水泡性口炎病毒感染埃及果蝠細胞，發現IFN-ω4阻止病毒感染，證明其干擾素可誘導一種減少免疫相關病理反應的應答；盡管目前各種實驗證實干擾素確實在蝙蝠抗病毒過程中發揮重要作用，但干擾素刺激基因（stimulator of interferon genes，STINGs）關鍵結合位點的保守氨基酸缺失也導致IFN-β 表達降低，因此蝙蝠的干擾素抗病毒作用有待商榷［1，33，40］。

NK 細胞可在固有免疫系統中消滅被病毒感染的細胞，NK 細胞有2種受體，一是促進NK 細胞殺傷作用的激活型受體，另一種是阻礙NK 細胞應答的抑制型受體。雖然既往研究認為NK 細胞受體在大部分蝙蝠中是缺失的，但研究證實，埃及果蝠中存在多個NK 細胞受體抑制基因，如NKG2-13 和NKG2-14，而這2 個基因在外周血和體液中大量存在，并主要激活抑制型信號通路，隨后進一步篩查其他蝙蝠基因組，發現多個類似 NKG2 的基因［33，41］。同時，埃及果蝠中的MHCⅠ型分子基因在基因組中發生大量擴增，并與小鼠和人類的傳統MHCⅠ坐落位點相比，埃及果蝠的MHCⅠ型分子分布更為廣泛；作者認為這些經典MHC位點外的Ⅰ型分子基因擴增產生配體冗余，直接提高NK 細胞激活閾值，最終導致NK 細胞較低的活動性；另有研究者從蝙蝠攜帶的病毒中發現，MHCⅠ型分子結合肽具有額外表面錨定位點，這些額外位點可加強T 細胞識別并通過抑制病毒復制導致更低的突變率［42］。以上發現為進一步研究蝙蝠病毒感染后無癥狀的機制提供了重要信息。

3.3 蝙蝠適應性免疫系統與抗病毒應答 適應性免疫系統在機體應對病原體入侵中處于核心地位，病毒逃逸固有免疫防線后面對適應性免疫的第二道防線。適應性免疫應答包括由T細胞介導的細胞免疫和B 細胞介導的體液免疫，由于適應性免疫在抗病毒方面發揮重要作用，因此蝙蝠適應性免疫系統研究備受關注。目前已明確在蝙蝠體內存在T/B細胞介導的免疫反應，對蝙蝠T 細胞類群及功能的研究較少，尤其是沒有針對T 細胞亞群分析或分選的試劑極大限制了蝙蝠T 細胞研究。20 世紀70 年代體外實驗發現，多種蝙蝠細胞能夠針對T 細胞有絲分裂原產生應答，并相比于小鼠應答時間，蝙蝠應答時間更長。而蝙蝠B 細胞應答研究在開始于20世紀60年代，蝙蝠（大棕蝠）針對抗原刺激產生的抗體滴度比其他實驗室動物（兔和豚鼠）更低，產生抗體的時間更長，但明確證實蝙蝠類似于其他哺乳動物，能夠針對抗原刺激產生抗體，且蝙蝠在應答機制上與小鼠類似，如多次免疫發現，大棕蝠體內產生的抗體親和力逐漸升高，提示蝙蝠產生抗體伴隨高頻突變。多個實驗均證實，采用抗原刺激野生蝙蝠和刺激實驗蝙蝠均能夠監測到針對抗原刺激發生抗體參與免疫應答［43-48］。CHAKRABORTY 和WELLEHAN 等［49-50］實驗證明，蝙蝠針對抗原刺激產生相應抗體同時，其初次應答及再次應答時間較其他實驗動物延長。

2011 年，BUTLER 等［51］對 4 種蝙蝠體內抗體類型進行鑒定，包括IgM、IgG、IgD、IgA 和IgE 5 種哺乳動物經典抗體，并對免疫球蛋白重鏈基因座結構解析發現，其抗體類型與哺乳動物大致相同，因此認為蝙蝠適應性免疫系統進化方向與哺乳動物無顯著差異，但蝙蝠在生物界獨特的抗病毒機制尚未闡明，鑒于目前有限的蝙蝠適應性免疫系統信息，未來對其研究將對人類抗病毒產生重要影響。

4 展望

蝙蝠作為一種數目眾多、分布廣泛的動物，是百余種病毒的天然宿主，其在攜帶并傳播病毒方面的作用備受關注，而其“攜帶病毒而能耐受”的特點，提示其與蝙蝠特殊的免疫系統相關。目前對蝙蝠免疫系統的有限解析是進一步探索其抗病毒機制的難題。最近對蝙蝠細胞譜系方面的相關研究加深了其與病毒相互作用的認識［52］。2013 年，中國、澳大利亞和美國研究者合作完成了對澳大利亞狐蝠和中國大衛鼠耳蝠的基因組測序工作［32］，越來越多的實驗室進行不同蝙蝠基因組測序工作和數據共享，為研究蝙蝠固有和獲得性免疫系統組成和特征提供了基礎，課題組在國家自然科學基金資助下，采用高通量測序技術解析蝙蝠T、B 細胞受體庫特征，探討蝙蝠在與病毒相互作用中特異性免疫應答系統產生耐受的可能機制，為全面解析蝙蝠免疫系統組成和應答機制提供基礎數據。人類與病毒關系研究中，蝙蝠攜帶病毒耐受的機制可為研究人體抗病毒免疫應答機制、控制病毒感染、病毒疫苗開發等提供新思路和措施。