桑黃液體培養基優化及飲品加工工藝

謝春芹，許俊齊，黃小忠，張雪松，張博士

江蘇農林職業技術學院（句容 212400）

桑黃（Phellinus igniarius）是一類具有重要藥用價值的大型真菌，屬擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、層孔菌屬[1]。學名鮑氏層孔菌，又稱火木層孔菌、桑臣、桑耳等，子實體無柄，菌蓋扁馬蹄形或半球形，木質，淺肝褐色至暗灰色或黑色，是一種寄生于腐爛桑樹上的多年生真菌。桑黃中的活性成分具有抗菌、抗癌、保肝、提高免疫力的功效，是目前國際公認的生物抗癌領域中療效非常好的藥用真菌[2-5]。

桑黃作為一種名貴中藥，富含豐富的多糖類、黃酮類、酚類和萜類等成分[6]。其抑制腫瘤的研究主要集中在具有藥理功能的成分桑黃多糖方面，桑黃的抗癌多糖來源包括子實體多糖、菌絲體及發酵液多糖。作用機制是通過細胞調節和體液免疫來提高機體的免疫力，進而達到抑制腫瘤細胞生長和轉移的目的[7-9]。

由于受自身生物特性和外界環境的影響，野生桑黃菌子實體稀少，人工栽培周期長，無法滿足人們對珍稀桑黃菌資源的廣泛需求，對桑黃菌進行人工發酵培養以獲取桑黃菌絲體為其產業化開發提供了可能，且發酵周期短，不受季節和環境的限制，發酵所得菌絲體多糖與子實體多糖功效相當[10]。

此次試驗通過對桑黃進行液體深層發酵培養，分析相應碳源、氮源及微量元素對其菌絲干質量與總多糖含量的影響。在此基礎上，對桑黃菌絲發酵飲品調配配方進行優化，以期為桑黃菌絲新型產品開發提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑黃，由江蘇食用菌研究所提供；白砂糖、馬鈴薯等，為市售食品級；葡萄糖、磷酸二氫鉀、蛋白胨，國藥集團化學試劑有限公司。

恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；FA 2104 N分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；DHG-9123 A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；L 520微波爐（合肥榮事達三洋電器股份有限公司）；CH2176電磁爐（杭州九陽生活電器有限公司）；HS-6恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 培養基

1.2.1 斜面PDA培養基

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

200 g馬鈴薯切成1 cm3的小塊，倒入1 000 mL的水中，煮沸至變軟，用四層紗布過濾，過濾以后的濾液內加入瓊脂葡萄糖，繼續加熱，不停地攪拌，然后補水至1 000 mL，將桑黃菌接種于PDA斜面培養基上，于28 ℃恒溫培養6 d。

1.2.2 一級液體培養基

葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，VB10.005%，余量為水。

向250 mL三角瓶中加入100 mL一級液體培養基，進行120 ℃滅菌30 min。接種斜面保存的桑黃菌，置于28 ℃，120 r/min的搖床環境中培養6 d。

1.2.3 二級液體培養基

馬鈴薯20%，硫酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，VB10.005%，余量為水。

用打孔器從平板中取出5塊直徑5 mm的活化菌種塊，接入液體種子培養基中，在120 r/min，25 ℃，無光的環境中培養7 d。

1.3 試驗方法

1.3.1 桑黃菌絲飲品加工步驟

1.3.1.1 菌種活化

將桑黃菌種接種到斜面培養基上，在28 ℃的生化培養箱中培養5~7 d，菌絲可長滿試管。

1.3.1.2 一級搖瓶培養

將經過活化的桑黃菌種接種到搖瓶培養基中（500 mL的三角瓶裝液150 mL），一級搖瓶培養條件為接入經過斜面培養的桑黃菌種2 cm2，在28 ℃條件下振蕩培養5~6 d。

1.3.1.3 二級搖瓶培養

將一級搖瓶培養桑黃菌種，接種到搖瓶培養基中進行二級搖瓶培養，在28~30 ℃條件下，培養8 d，所得桑黃菌種為生產搖瓶二級種。

1.3.1.4 發酵培養

將二級種接入發酵培養基中，二級種與發酵培養基的體積比為10%的接種量接種于發酵培養基中，發酵培養5 d，進行擴大培養，得到一級桑黃菌種。

1.3.1.5 發酵罐培養

一級桑黃菌種接入裝有發酵培養基的發酵罐中進行發酵罐培養24~36 h后，過濾，得桑黃菌絲。

1.3.1.6 桑黃菌絲飲品制備

過濾后的桑黃菌絲球于50~55 ℃烘干至恒質量，研磨粉碎后過0.15 mm篩。將桑黃菌絲球粉∶水=1∶5進行均質研磨，均質完成后在桑黃菌絲球混液中加入0.2%纖維素酶，混勻后在38 ℃條件下保溫水解1.5 h，將混合料在100 ℃下殺菌10 min。

將準備好的桑黃菌絲酶解濾液分別加入溶解完成的果膠及黃原膠，再依次加入復合膠、鮮柚濃縮汁、蜂蜜、檸檬酸、檸檬酸鈉，后攪拌均勻，最后補水至配方規定的量；將定容后的料液加熱至沸，趁熱加灌入已滅菌的飲料瓶，壓蓋后105 ℃下殺菌10 min，冷卻后得桑黃菌絲發酵飲品。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 碳源篩選

用電子天平稱取一定量的葡萄糖和玉米粉，設置5個濃度梯度：4 g/L+6 g/L，6 g/L+8 g/L，8 g/L+10 g/L，10 g/L+12 g/L和12 g/L+14 g/L。玉米粉先煮沸，后用四層紗布過濾，再把濾液和一定量的葡萄糖裝入有0.6 g蛋白胨，8.0 g麩皮，0.28 g MgSO4和0.6 g KH2PO4的1 000 mL的無菌玻璃容器中攪拌均勻。每個配方重復3次，分裝至250 mL錐形瓶中，加入100 mL配制好的液體培養基，于121 ℃滅菌30 min。在無菌條件下冷卻至室溫。

1.3.2.2 氮源篩選

用電子天平稱取定量的蛋白胨和麩皮，設置濃度0.3 g/L+3.0 g/L，0.4 g/L+4.0 g/L，0.5 g/L+5 g/L，0.6 g/L+6 g/L，0.7 g/L+7 g/L和0.8 g/L+8 g/L。麩皮煮沸后用四層紗布過濾，再將濾液及定量的蛋白胨裝入加有4.0 g葡萄糖，5.6 g玉米粉，0.28 g MgSO4和0.6 g KH2PO4的1 000 mL的無菌玻璃容器中，攪拌均勻。每個配方重復3次，每個250 mL錐形瓶中加入100 mL液體培養基，于121 ℃滅菌30 min。在無菌條件下冷卻至室溫。

1.3.2.3 礦物質元素篩選

用電子天平稱取定量的MgSO4和KH2PO4，5.6 g玉米粉和8.0 g麩皮，先煮沸，后用四層紗布過濾，再向濾液中裝入加有4.0 g葡萄糖，0.6 g蛋白胨，以及不同濃度梯度的MgSO4和KH2PO4攪拌均勻。MgSO4+KH2PO4濃度梯度為0.6 g/L+6 g/L，0.8 g/L+8 g/L，1 g/L+10 g/L，1.2 g/L+12 g/L和1.4 g/L+14 g/L。每個配方重復3次，每個250 mL錐形瓶中加入100 mL液體培養基，于121 ℃滅菌30 min。在無菌條件下冷卻至室溫。

故碳源葡萄糖和玉米粉添加量為4 g/L+6 g/L，6 g/L+8 g/L，8 g/L+10 g/L，10 g/L+12 g/L和12 g/L+14 g/L；氮源蛋白胨+麩皮添加量為0.4 g/L+2.0 g/L，0.5 g/L+3 g/L，0.6 g/L+4 g/L，0.7 g/L+5 g/L和0.8 g/L+6 g/L；微量元素MgSO4和KH2PO4添加量為0.2 g/L+0.5 g/L，0.3 g/L+0.75 g/L，0.4 g/L+1 g/L，0.5 g/L+1.25 g/L和0.6 g/L+1.5 g/L，并以菌絲體干質量及總多糖含量為評價指標，試驗重復3次，取平均值，確定三者最優的添加量。

1.3.3 正交試驗

在前期試驗基礎上，判定液體培養基中碳源（葡萄糖+玉米粉）、氮源（蛋白胨+麩皮）及微量元素（MgSO4+KH2PO4）對桑黃液體菌絲生長情況存在顯著影響，從單因素試驗中篩選出的不同水平的葡萄糖+玉米粉、蛋白胨+麩皮、MgSO4+KH2PO4，并設置一列空白列，進行L9(34)正交試驗，因素及水平設定見表1。每個處理3次重復，進行振蕩培養，測定其菌絲體干質量及總多糖含量。

表1 桑黃液體培養基正交L9(34)試驗因素與水平單位：g/L

1.3.4 正交試驗

在前期試驗基礎上，白砂糖、檸檬酸及果膠和黃原膠為影響桑黃菌絲體發酵飲品的關鍵因素。設置白砂糖添加量為2%，4%和6%，設置檸檬酸添加比例為0.11%，0.13%和0.15%，設置果膠與黃原膠添加比例為0.08%+0.1%，0.10%+0.2%和0.12%+0.3%，進行L9(34)正交試驗，因素及水平設定見表2。

表2 桑黃菌絲發酵飲品L9(34)試驗因素與水平單位：%

1.3.5 指標測定方法

1.3.5.1 感官評定

感官評分標準：為了能夠確定桑黃菌絲飲品質量，對制得的產品取試樣置于透明玻璃杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態；用溫開水漱口，品嘗其口感，感受其風味為指標分五組，每組10人。感官評價由10名具有品評經驗的食品專業同學進行評價，取其平均值。以100分計對產品進行感官評分鑒定，確定最佳配方。

色澤（0~30分）：色澤黃亮，質地均勻，無分層，無沉淀，穩定性好。

風味（0~30分）：特有香氣純正濃郁，柔和。

口感（0~40分）：飲品酸甜平衡，無異味或苦味，口味醇厚，協調柔和。

1.3.5.2 桑黃菌絲體干質量測定方法

桑黃菌絲體發酵液，采用150 μm篩網過濾，將菌絲體用蒸餾水抽濾3次。裁剪無紡布，并記下質量M1，將抽濾3次后的菌絲體放在無紡布上，置于DHG-9123 A電熱鼓風干燥箱中55°烘干至恒重，再次稱取其質量得M2，即得桑黃菌絲體干質量M0=M2-M1。

1.3.5.3 總多糖測定

總多糖測定：參照苯酚-硫酸法[11]。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖及玉米粉添加量對桑黃菌絲體干質量及總多糖含量的影響

桑黃菌絲體對于葡萄糖利用率較高，前期能滿足菌絲生產的需要。而玉米粉可被桑黃菌絲緩慢分解，有益于桑黃菌絲后期多糖物質的累積。因此，在桑黃液體培養基中加入混合碳源葡萄糖和玉米粉后，隨著添加比例的增加，桑黃菌絲體的干質量和總多糖含量增加。葡萄糖和玉米粉對桑黃菌絲體干質量和總多糖含量的影響如圖1所示。由圖1可看出，隨著葡萄糖和玉米粉的添加量越來越高，桑黃菌絲體干質量先快后慢的升高過程。當葡萄糖和玉米粉的添加量10 g/L和12 g/L時，桑黃總多糖含量達到峰值為0.435 g/L，桑黃干質量為0.726 g/100 mL；葡萄糖和玉米粉用量分別為12 g/L和14 g/L時，桑黃菌絲體干質量和總多糖含量為0.392 g/L和0.732 g/100 mL。最后確定混合碳源的最佳配比是：葡萄糖和玉米粉10 g/L和12 g/L。

圖1 葡萄糖及玉米粉添加量對桑黃菌絲體干質量及總多糖含量的影響

2.2 蛋白胨及麩皮添加量對桑黃菌絲體干質量及總多糖含量的影響

蛋白胨和麩皮屬于有機氮化合物，常被用作微生物培養基中的氮源。此外，麩皮中含有多種維生素和糖類，且價格低廉。圖2為蛋白胨及麩皮添加量對桑黃菌絲體干質量及總多糖含量的影響。結果表明，當蛋白胨和麩皮的添加量為0.6 g/L+4.0 g/L時，每100 mL液體培養基中菌絲體的干質量為0.673 g/100 mL，總多糖含量為0.49 g/L，隨著添加量的增加，菌絲體的干質量先增大后減小，總多糖含量達到一定程度后有明顯下降。據此分析可知，選擇蛋白胨和麩皮0.6 g/L+4.0 g/L為最佳混合氮源培養基。

圖2 蛋白胨+麩皮添加量對桑黃菌絲體干質量及總多糖含量的影響

2.3 MgSO4+KH2PO4添加量對桑黃菌絲體干質量及總多糖含量的影響

MgSO4和KH2PO4添加量對桑黃菌絲體干質量及多糖含量的影響見圖3。由圖3分析可知，桑黃菌絲體的干質量及總多糖含量隨著MgSO4和KH2PO4添加量的增加呈現先增后減。當MgSO4和KH2PO4的添加量為0.5 g/L+1.25 g/L時，菌絲體的干質量為0.687 g/100 mL，總多糖含量為0.51 g/L，同比高于其他試驗組。由此分析可知，MgSO4和KH2PO4的最佳添加量為0.5 g/L+1.25 g/L。

圖3 MgSO4+KH2PO4添加量對桑黃菌絲體干質量及總多糖含量的影響

2.4 桑黃液體培養基工藝優化

2.4.1 正交試驗結果的極差分析

由表3液體培養基優化正交試驗表中的R值可知，影響桑黃菌絲干質量及總多糖含量的主次順序皆為A＞B＞C，即葡萄糖與玉米粉添加量＞蛋白胨與麩皮添加量＞硫酸鎂與磷酸二氫鉀添加量。根據液體培養基配方及培養條件優化的結果分析得出，優化后的配方為A2B2C3及A2B3C3，即葡萄糖與玉米粉添加量為10 g/L+12 g/L，蛋白胨和麩皮添加量0.6 g/L+4.0 g/L（0.7 g/L+5.0 g/L）、MgSO4及KH2PO4添加量為0.6 g/L+1.5 g/L，桑黃菌絲在此配方及環境條件下生長狀況良好，總多糖含量保持在較高水平。

表3 桑黃液體培養條件及培養基L9(34)試驗結果分析

對試驗結果進行方差分析，即在試驗條件下，葡萄糖與玉米粉添加量對桑黃菌絲總多糖及菌絲體干質量影響皆顯著（0.01＜p＜0.05）。蛋白胨和麩皮添加量僅對桑黃菌絲干質量影響顯著（0.01＜p＜0.05），MgSO4及KH2PO4添加量對桑黃菌絲總多糖及菌絲體干質量影響皆不顯著。

2.4.2 擴大性驗證試驗

獲得優化方案A2B2C3及A2B3C3，為進一步確認其在實際生產中的可靠性與可行性，故以其為條件，即葡萄糖與玉米粉添加量為10 g/L+12 g/L，蛋白胨和麩皮添加量0.6 g/L+4.0 g/L（0.7 g/L+5.0 g/L），MgSO4及KH2PO4添加量為0.6 g/L+1.5 g/L，進行擴大性（中試）驗證試驗，試驗重復3次，測定其菌絲干質量及總多糖含量。經試驗，蛋白胨和麩皮添加量為0.7 g/L+5.0g/L，在該條件下桑黃菌絲體干質量（0.823±0.014）g/100 mL，總多糖含量為（0.493±0.018）g/L，表明該配方為較佳的桑黃液體培養配方組成。

2.5 桑黃菌絲飲品調配工藝優化

2.5.1 正交試驗結果的極差分析

桑黃菌絲飲品調配L9(34)試驗結果見表4，桑黃菌絲飲品方差分析見表5。

從表4桑黃菌絲飲品調配工藝的正交試驗結果中的R值可知，影響其綜合評分的因素主次順序為A＞B＞C，即白砂糖＞檸檬酸＞復合膠（果膠和黃原膠）。依據綜合評分的結果分析可知，優化的工藝組合均為A2B3C3，即白砂糖添加量4%、復合膠（果膠和黃原膠）添加量0.12%+0.3%、檸檬酸0.15%，制得的飲品外觀、口感及風味的綜合值評價最好。

表4 桑黃菌絲飲品L9(34)試驗結果

對試驗結果進行方差分析，表5數據顯示，在試驗條件下，白砂糖添加量與檸檬酸添加量對桑黃菌絲飲品的綜合口感影響顯著（p＜0.05），而復合膠（果膠和黃原膠）對其影響不顯著（p＞0.05）。

表5 桑黃菌絲飲品方差分析

2.5.2 擴大性驗證試驗

獲得的優化方案A2B3C3為試驗第6組試驗，為確認其在實際生產中的可靠性與可行性，以其為條件，即桑黃菌絲飲品調配配方為白砂糖添加量4%、復合膠（果膠和黃原膠）添加量0.12%+0.3%、檸檬酸0.15%，進行擴大性驗證試驗，試驗重復3次，經品評后，綜合得分達87.8分，試驗結果均優于正交試驗的6組試驗組，表明該配方為較佳的桑黃菌絲飲品的適宜配方。

3 結論

對桑黃液體培養基碳源、氮源、礦物質添加量進行優化，試驗結果為：蛋白胨和麩皮添加量0.7+5.0 g/L、葡萄糖和玉米粉的添加量為10.0 g/L+12.0 g/L、MgSO4及KH2PO4添加量為0.6 g/L+1.5 g/L時，菌絲干質量平均值為（0.823±0.014）g/100 mL，總多糖含量為（0.493±0.018）g/L；在對桑黃菌絲發酵飲品調配工藝過程中，通過正交試驗分析得出，最優組合為白砂糖添加量4%、復合膠（果膠和黃原膠）添加量0.12%+0.3%、檸檬酸0.15%，以綜合感官評價認為此配方制得的桑黃菌絲飲品，在保證口感的同時，后期貯藏驗證其穩定性也較高。

通過對在最佳工藝條件下制得的桑黃發酵菌絲飲料進行感官評價，其色澤黃亮，質地均勻，無分層，無沉淀，穩定性好。特有香氣純正濃郁，柔和。飲品酸甜平衡，無異味或苦味，口味醇厚，協調柔和。在保留桑黃菌絲原有的活性功能基礎上，桑黃飲品的風味獨特，口感更加細膩，具有良好的市場前景。