酶法輔助PEG-200超聲波提取葵花籽仁中綠原酸的工藝優(yōu)化

劉霞，廖梅香，羅江浩

贛南醫(yī)學(xué)院（贛州 341000）

菊科植物向日葵（Helianthus annuusL.）系一年生草本植物，別名葵花、草天葵、望日蓮、太陽花、朝陽葵等[1]。向日葵的種子（葵花籽）中油脂含量豐富，含有超過85%的不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸中又含有近65%的亞油酸[2]，此外葵花籽中還具有葵花籽蛋白和綠原酸等物質(zhì)。目前我國對向日葵的使用加工僅限于油脂的提取[3]，關(guān)于葵花籽中綠原酸的提取卻較少提及。綠原酸作為葵花籽發(fā)揮藥理作用的有效成分之一，具有抑菌消炎、促進凝血、清除體內(nèi)自由基、維持血糖平衡、預(yù)防心腦血管疾病等多種功效[4]。另外，綠原酸還因其抗炎、抗氧化、抑菌和防輻射的藥效被廣泛用于食品、化妝品和化工等領(lǐng)域[5-7]。正因為綠原酸在各領(lǐng)域上的廣泛使用，對綠原酸的提取就顯得意義重大。

目前，采用酶法輔助PEG-200超聲波提取葵花籽仁中綠原酸的研究尚未見報道。試驗以葵花籽仁為原材料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法設(shè)計原理，優(yōu)化工藝條件，為葵花籽仁綠原酸的深入研究做準備，并為其綜合開發(fā)利用提供一定的理論參考和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

葵花籽仁，市售；綠原酸標準品，天津一方科技有限公司；纖維素酶（5×104U·g-1），江蘇銳陽生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

SPECORD 50 PLUS型紫外分光光譜儀（德國耶拿分析儀器股份公司）；ME104/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（金壇市城東新瑞儀器廠）；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；202A-2型電熱恒溫干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

參照文獻[8]綠原酸標準曲線測定方法。精密稱取10.16 mg于120 ℃減壓干燥至恒重的綠原酸標準品于100 mL容量瓶中，并用體積分數(shù)為30% PEG-200定容，搖勻，即得101.6 μg·mL-1的綠原酸標準品溶液。精密量取0，0.3，0.6，0.9，1.2和1.5 mL該綠原酸標準品溶液，分別置于10 mL容量瓶中，分別加體積分數(shù)為30% PEG-200至刻度，搖勻，靜置，配制成0，3.12，6.23，9.35，12.47和15.59 μg·mL-1一系列標準溶液。在最大吸收波長329 nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，綠原酸標準品溶液質(zhì)量濃度C為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程A=0.051C+0.003 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

1.2.2 葵花籽仁綠原酸的提取過程

葵花籽仁→烘干→粉碎→過篩→脫脂（用一定比例的石油醚）→溶解（體積分數(shù)為30%的PEG-200）→調(diào)節(jié)pH→酶解（加纖維素酶）→超聲提取（50 ℃）→趁熱過濾→濾液減壓濃縮→定容

4.腹部按摩，從右下腹開始，以輕柔力道做順時鐘方向按摩，每次10～20圈，一天2～3次，可幫助舒緩腹脹感。

1.2.3 綠原酸提取率測定

將上述提取液按一定比例稀釋后，按1.2.1的測定方法測定吸光度，并計算綠原酸提取率。

1.2.4 單因素試驗

選取酶用量、酶解時間、酶解溫度、液固比及超聲時間進行單因素試驗，研究它們對葵花籽仁綠原酸提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計[9]

試驗的水平因素見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶用量對綠原酸提取率的影響

由圖1可知：當酶用量為0~1.0%時，綠原酸提取率逐步增大；當酶用量為1.0%時，綠原酸的提取率達到最大值3.24%；后續(xù)增大酶用量，綠原酸提取率開始下降。這是因為前期隨著酶用量的增加，酶與底物接觸概率增大，酶解反應(yīng)速率加快；后續(xù)增加酶用量，會導(dǎo)致反應(yīng)系統(tǒng)中底物濃度相對不夠，酶促反應(yīng)速度下降，因而綠原酸浸出率降低[10]。因此最佳試驗條件選擇1.0%酶用量。

圖1 酶用量對綠原酸提取率的影響

2.1.2 酶解溫度對綠原酸提取率的影響

圖2 酶解溫度對綠原酸提取率的影響

2.1.3 酶解時間對綠原酸提取率的影響

由圖3可以看出，隨著酶解時間的延長，綠原酸提取率先逐漸增加，當酶解時間為1.5 h時，提取率達到峰值3.34%，之后隨著酶解時間的增加，提取率緩緩下降。這是因為綠原酸本身結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，長時間加熱或見光的條件將其易氧化分解[11]，因而提取率降低。因此試驗將酶解時間定為1.5 h。

圖3 酶解時間對綠原酸提取率的影響

2.1.4 液固比對綠原酸提取率的影響

由圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)液固比越大，綠原酸提取率越高。當液固比為20∶1（mL/g）時，綠原酸提取率可達峰值3.42%，之后綠原酸提取率開始逐步下降。這是因為PEG-200作為非離子型表面活性劑，可明顯降低界面張力，增加細胞膜的滲透性；此外PEG與水混合后形成膠束，綠原酸的非極性基團可進入膠束內(nèi)核被增溶，使綠原酸更易溶于水中。而液固比超過其最佳比后，其他物質(zhì)也會相應(yīng)進入膠束內(nèi)核，占據(jù)一定的體積后被增溶[12]，使綠原酸的溶出減少，提取量反而降低。因此選擇20∶1（mL/g）為最佳液固比。

圖4 液固比對綠原酸提取率的影響

2.1.5 超聲時間對綠原酸提取率的影響

由圖5可知：超聲時間對綠原酸提取率的影響是一個先急速上升后緩緩下降的過程；當在超聲時間為30 min時，綠原酸提取率達到峰值3.39%，之后提取率開始下降，因此選擇30 min為最佳超聲時間。

圖5 超聲時間對綠原酸提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面中心組合試驗方案與結(jié)果見表2。應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對表2進行回歸擬合，得出方差分析表，見表3。

表2 Box-behnken中心組合試驗結(jié)果

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

經(jīng)過二次回歸擬合分析獲得葵花籽仁中綠原酸提取率（Y）與酶用量（A）、酶解時間（B）、液固比（C）和超聲時間（D）之間的擬合方程：Y=1.345 4+0.295 0A+3.720 0B-0.068 8C-5.000 0E-004D-0.610 0AB+0.093 0AC-5.500 0E-003AD-0.052 0BC+7.000 0E-003BD+1.850 0E-003CD-0.615 0A2-0.845 0B2-3.000 0E-004C2-5.750 0E-004D2。

由表3可知：回歸方程的p＜0.01，表明該回歸模型達到極顯著水平。該擬合模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.966 5，調(diào)整系數(shù)Radj2=0.933 0，均大于90%，表明回歸模型擬合良好，試驗誤差小，可用于擬合酶法輔助PEG-200提取葵花籽仁中綠原酸的過程。一次項A、B、C、D，交互項AB、AC、BC、CD，二次項A2、B2、D2的p值均小于0.05，表明酶用量、酶解時間、液固比和超聲時間對葵花籽仁中綠原酸的提取量均有顯著影響，且影響順序（主→次）為酶解時間＞酶用量＞超聲時間＞液固比。交互項AB、AC、BC、CD的p值均小于0.01，表明酶用量與酶解時間、酶用量與液固比、酶解時間與液固比、液固比與超聲時間的交互作用對葵花籽仁中綠原酸的提取量均有極其顯著影響。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析及最佳提取工藝研究

各試驗因素間的交互作用對葵花籽仁綠原酸提取率的影響可從響應(yīng)曲面圖直觀地觀察。由圖6可以看出：酶用量與酶解時間、酶用量與液固比對葵花籽仁綠原酸提取率具有最顯著的交互作用，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面比較陡峭；酶解時間與液固比、液固比與超聲時間交互作用的影響次之，表現(xiàn)為曲面坡度稍平緩。各試驗因素間的交互作用對葵花籽仁綠原酸提取率的影響與表3中的方差分析結(jié)果一致。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行優(yōu)化分析，最佳工藝參數(shù)確定為酶用量0.5%、酶解時間1.7 h、液固比15∶1（mL/g）、超聲時間32 min。在此工藝條件下進行3次驗證試驗，實際得到的提取率為3.49%，與預(yù)測值3.55%相差較小，相對誤差為1.69%，表明該模型可以較好地擬合葵花籽仁綠原酸的提取過程。

2.3 不同提取方法的對比

由表4可知：與超聲法相比，酶法聯(lián)合超聲法提取葵花籽仁中綠原酸雖耗時更長，但提取率增加近1倍；與酶法聯(lián)合回流法相比，提取時間縮短，提取率卻增加，這可能與綠原酸在長時間高溫條件下發(fā)生水解和氧化有關(guān)。由此說明酶法聯(lián)合超聲法可顯著提高葵花籽仁中綠原酸的得率。

表4 不同提取方法提取葵花籽仁中綠原酸的比較（±s，n=3）

表4 不同提取方法提取葵花籽仁中綠原酸的比較（±s，n=3）

序號 提取方法 提取時間 葵花籽仁綠原酸提取率/%1 酶法聯(lián)合超聲法 134 min 3.49±0.35 2 超聲法 30 min 2.03±0.24 3 酶法聯(lián)合回流法 3.5 h 3.08±0.17

3 討論與結(jié)論

通過響應(yīng)面分析方法的優(yōu)化，采用酶法輔助PEG-200提取葵花籽仁中綠原酸的最佳工藝條件為酶解溫度50 ℃、酶用量0.5%、酶解時間1.7 h、液固比15∶1（mL/g）、超聲時間32 min。在此工藝條件下實際提取率為3.49%，相對誤差為1.69%，表明該設(shè)計方法對葵花籽仁綠原酸提取工藝的優(yōu)化具有可行性。該方法與超聲法單技術(shù)相比，雖耗時更長，但提取率增加近1倍；與酶法聯(lián)合回流法相比，該方法提取時間縮短，提取率卻增加，這可能與綠原酸在長時間高溫條件下發(fā)生水解和氧化有關(guān)。由此說明酶法聯(lián)合超聲法可顯著提高葵花籽仁中綠原酸的得率。該研究結(jié)果可為葵花籽綠原酸的提取提供一定的參考依據(jù)和借鑒作用。