響應面法優化β-環糊精輔助提取水飛薊賓工藝

劉芳，瞿曉梅，趙婷，李紫嫣，劉玉璇，國大亮

天津中醫藥大學（天津 301617）

水飛薊Silybum marianum（L.）是一種菊科水飛薊屬1年生或2年生草本植物[1-3]，水飛薊素是從水飛薊果實中提取出來的一種黃酮類物質，主要成分為水飛薊賓[4-6]。其具有保肝[7-10]、抗癌[11-12]、抗菌[13]、抗血小板聚集[14]、抗炎和抗氧化[15]等藥理作用。水飛薊果實不僅具有較高的藥用價值，其營養價值也很高，將水飛薊賓加入到各種食品或飲料，制成保健食品或飲料，拓寬了水飛薊賓的應用范圍[16]。

β-環糊精（β-CD）具有外親水內疏水的特殊結構，能夠選擇性包合難溶的藥物成分，通過增加其溶解度提高中藥有效成分的提取率[17]，在中藥提取工藝上有著潛在的優勢，因此得到越來越廣泛的應用[18]。從水飛薊中提取水飛薊賓是此中藥開發利用的重要環節，目前水飛薊賓的提取方式有超聲輔助有機溶劑提取[19-20]，堿提酸沉法[21]，超聲輔助雙水相體系提取[22]。試驗通過β-CD輔助提取提高水飛薊賓的提取率，以期在后續食品開發和工業生產中提供理論依據。

響應面法是利用中心組合試驗擬合出二次多項式模型，通過回歸分析尋找最優工藝參數[23]。試驗以水飛薊果實為原料，采用響應面法優化試驗得出最佳提取工藝條件，從而提高水飛薊賓得率。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與設備

Series III高效液相色譜儀（美國實驗儀器公司）；UV-6100紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-DⅢ循環水浴真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；KQ-250DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.2 試驗材料與試劑

水飛薊賓對照品（≥98%，ChemFaces）；水飛薊籽（安國市聚藥堂藥業有限公司，產品批號2008001）；β-環糊精[中國醫藥（集團）上?；瘜W試劑公司]；甲醇（色譜純，SIGMA-ALDRICH）、冰醋酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 水飛薊賓含量測定分析方法的建立

1.3.1.1 含量測定方法

1.3.1.1.1 色譜條件的確定

色譜柱Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm）；流動相為甲醇-水-冰醋酸=48∶52∶1（V/V）；流速1 mL/min；檢測波長287 nm；柱溫采用室溫[24]。

1.3.1.1.2 標準溶液的配制

精密稱取10.08 mg水飛薊賓對照品，置于50 mL容量瓶中加甲醇溶解制備成質量濃度0.201 6 mg/mL的標準儲備液。

1.3.1.1.3 供試品溶液的配制

精密稱取水飛薊賓提取物，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲使其充分溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

1.3.1.1.4 紫外最大吸收波長的選擇

以標準儲備液為母液，精密吸取5 mL，置于10 mL容量瓶中，加色譜甲醇稀釋至刻度，在200~400 nm進行全波長掃描。

1.3.1.2 含量測定方法學考察

1.3.1.2.1 線性關系考察

精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和5.0 mL水飛薊賓對照品溶液，置10 mL量瓶中，加色譜甲醇稀釋至刻度，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液按上述色譜條件進樣測定。以峰面積y為縱坐標，濃度x為橫坐標，進行線性回歸，其回歸方程為y=8 816.4x-9 505，R2=0.999 1。

1.3.1.2.2 精密度考察

取20 μL同一對照品溶液，注入高效液相色譜儀，連續進樣6次，水飛薊賓對照品溶液SRSD=2.34%，表明高效液相儀器精密度良好。

1.3.1.2.3 穩定性考察

取同一份供試品溶液，分別于樣品制備后0，2，4，6，12和24 h進樣分析，SRSD=2.72%，說明穩定性良好，供試品溶液24 h內穩定性良好。

1.3.1.2.4 重復性考察

按照供試品溶液的配制方法，平行制備6份供試品溶液，注入高效液相色譜儀進樣分析，SRSD=1.96%，表示重復性良好。

1.3.1.2.5 加樣回收率考察

精密稱取6份已知含量的供試品，按水飛薊賓已知量的1倍加入對照品，同法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，計算加樣回收率。

結果顯示，水飛薊賓對照品溶液平均回收率為100.4%，SRSD為1.65%，說明高相液相檢測方法所測加樣回收率結果可靠。

表1 水飛薊賓加樣回收率結果

1.3.2 響應面法優化水飛薊賓提取工藝

1.3.2.1 水飛薊賓的提取

將完整的水飛薊籽粉碎過篩，加入一定量的β-環糊精，與一定量的溶劑混勻，在水浴鍋上加熱回流，將提取液過濾，旋轉蒸發。

1.3.2.2 單因素試驗

選取乙醇體積分數、料液比、β-環糊精加入量、提取時間4個因素作為自變量，水飛薊賓提取量作為響應值。各因素的水平梯度設置：乙醇體積分數為0，30%，50%，70%和90%；料液比為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）；β-環糊精加入量為0，5%，10%，15%和20%；提取時間為1，2，3，4和5 h。根據試驗結果選擇主要影響因素，根據響應面法設計水飛薊賓提取工藝，建立最優工藝。

1.3.2.3 Box-Behnken試驗設計

在已有試驗基礎上，根據各因素對提取工藝的影響，選取料液比、β-環糊精加入量、提取時間為自變量，以水飛薊賓提取量為評價指標進行星點設計試驗，采用Design Expert試驗設計軟件進行試驗。采用二次多項式擬合，建立方程式，根據最佳模型描繪響應面。試驗因素及各水平值見表2。

表2 水飛薊賓提取工藝響應面試驗因素與水平

1.3.2.4 最優處方驗證

根據Design Expert軟件所給出的最優提取工藝預測各因素的最優值，測定水飛薊賓提取量，與軟件所給出的預測值對比，驗證軟件的準確性。

2 結果與分析

2.1 紫外最大吸收波長的選擇

水飛薊賓對照品在200~400 nm進行全波長掃描，結果在287 nm處有最大吸收，故選擇287 nm為測定波長。

圖1 水飛薊賓全波長掃描圖

2.2 HPLC色譜圖（見圖2）

圖2 HPLC色譜圖

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 乙醇體積分數對水飛薊賓提取量的影響

由圖3可知，隨著乙醇體積分數增大，水飛薊賓提取量隨之增加，乙醇體積分數70%達到最大，乙醇濃度繼續增大，水飛薊賓提取量反而減小，可能是因為乙醇體積分數70%時，提取出的水飛薊賓量達到飽和，繼續增大乙醇濃度會將其他成分一并提取出來，造成水飛薊賓提取量降低。因此，選擇體積分數70%乙醇作為提取溶劑。

圖3 體積分數對水飛薊賓提取量的影響

2.3.2 料液比對水飛薊賓提取量的影響

由圖4可知，隨著料液比增加，水飛薊賓提取量隨著增大，料液比1∶15（g/mL）時提取量達到最大，料液比繼續增大，水飛薊賓提取量反而減小，可能是隨著料液比增加，其他水溶性物質也隨著提取出來，造成水飛薊賓提取量降低。所以，料液比選擇1∶15（g/mL）作為響應面試驗的中心點。

圖4 料液比對水飛薊賓提取量的影響

2.3.3β-環糊精加入量對水飛薊賓提取量的影響

由圖5可知，隨著β-環糊精增加，水飛薊賓提取量隨之增加，β-環糊精加入量10%時提取量達到最大，隨著β-環糊精繼續加入，水飛薊賓提取量降低?？赡苁怯捎讦?環糊精的包合作用。故選擇β-環糊精加入量10%作為中心點進行響應面試驗。

圖5 β-環糊精加入量對水飛薊賓提取量的影響

2.3.4 提取時間對水飛薊賓提取量的影響

由圖6可知，隨著提取時間延長，水飛薊賓提取量隨之增大，提取時間3 h時水飛薊賓提取量達到最大，隨著提取時間繼續延長，水飛薊賓的提取量反而降低，可能是隨著時間延長，水飛薊賓發生分解或提取出其他黃酮類物質造成提取量降低。故選擇3 h作為提取時間中心點進行響應面試驗。

圖6 提取時間對水飛薊賓提取量的影響

2.4 水飛薊賓的提取工藝優化

2.4.1 響應面設計結果

運用Design-Expert 8.0.6對表3中試驗結果進行多元線性回歸及二項式擬合，得到二項式擬合方程：水飛薊賓提取量=6.42+0.15A+0.29B+0.036C+0.24AB+0.60AC+0.12BC-0.87A2-1.14B2-0.20C2。

表3 水飛薊賓提取工藝優化試驗設計與結果

由表4可知，該模型p=0.000 1＜0.05，失擬項p=0.494 7＞0.05，說明該回歸方程擬合性、可信度良好，顯著性高，各試驗點均能以模型描述。R2=0.986 4說明試驗數據與模型相關性好，可用回歸方程對水飛薊賓的提取工藝過程進行預測和分析。分析各因素影響顯著性發現，一次項C及交互項BC不顯著，一次項A、B及交互項AB、AC，二次項A2、B2、C2均顯著說明試驗模型不是簡單的線性關系，適合應用星點-響應面進行分析優化。

表4 回歸方程方差分析

2.4.2 各因素交互作用響應面圖（見圖7~圖9）

圖7 料液比與β-環糊精加入量對水飛薊賓提取量影響的等高線圖與響應面圖

圖8 料液比與提取時間對水飛薊賓提取量影響的等高線圖與響應面圖

圖9 β-環糊精加入量與提取時間對水飛薊賓提取量影響的等高線圖與響應面圖

2.4.3 提取工藝條件優化預測

運用Design-Expert 8.0.6軟件優化所得的水飛薊賓最優提取工藝預測為料液比1∶16.8（g/mL）、β-環糊精加入量11%、提取時間3.7 h。在此條件下預測水飛薊賓含量為6.49 mg。

2.5 驗證試驗

按照響應面優化的最優條件進行驗證試驗，在其他因素固定不變的條件下，按照響應面軟件所得到的最優提取工藝提取水飛薊賓，測定的水飛薊賓提取量依次為6.37，6.58和6.28 mg/g。水飛薊賓提取量的預測值和實測值的相對誤差在1.2%，說明試驗所得數學模型可以較好的預測各因素和評價指標之間的關系，適用于該水飛薊賓提取量的提取工藝優化。

3 結論

試驗通過星點-響應面法優化β-環糊精輔助提取水飛薊賓的工藝研究，運用Design-Expert對數據進行擬合，建立各影響因素與響應值的數學模型。確定的最優提取條件為料液比1∶16.8（g/mL）、β-環糊精加入量11%、提取時間3.7 h。最佳提取條件下預測水飛薊賓提取量為6.49 mg/g。實測值與理論值總體吻合，說明模型能較好的預測響應值，優化條件可靠，具有實際應用價值。試驗表明，β-環糊精能顯著提高水飛薊賓提取率，為后續水飛薊賓的開發利用提供理論基礎。