黑果腺肋花楸花青素的分離純化

張卉，尤小明，劉姝含，臧淑艷

1.沈陽化工大學制藥與生物工程學院（沈陽 110020）；2.湖北黃岡市中心醫院（黃岡 438000）；3.沈陽化工大學理學院（沈陽 110020）

黑果腺肋花楸（Aronia prunifolia‘Viking’）屬薔薇科多年生落葉灌木，其果實中富含花青素。花青素不僅是一種天然可食用色素，而且具有抗腫瘤、抗氧化、預防糖尿病及高血壓的作用[1-3]。由于花青素是從植物中提取，導致純度低、雜質多，從而降低花青素的穩定性，影響其在原料藥及功能性食品的開發應用[4]。因此，深入研究花青素的純化工藝，對于花青素的進一步研發具有深遠意義。

近年來大孔吸附樹脂因具有吸附選擇性好、富集效果強、可重復利用等優點，常被應用于花青素分離純化研究[5]。王宏等[6]選用AB-8大孔樹脂來純化黑枸杞花青素，有效提高花青素純度。王維茜等[7]將刺葡萄皮中粗提液依次經大孔樹脂HP-20、聚酰胺樹脂、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20吸附純化，最終得到3種花色苷單體。張賽男等[8]使用HPD-100大孔樹脂純化玫瑰茄花色苷，將花青素的色價提高至38.5。國石磊等[9]采用大孔樹脂純化黑果腺肋花楸花青素，研究樹脂與花青素的吸附-解吸條件。尚未見到國內外學者對于大孔樹脂純化黑果腺肋花楸花青素的吸附性能做深入探討。因此，對純化黑果腺肋花楸花青素大孔樹脂的吸附型號、吸附條件及動力學深入研究，可為黑果腺肋花楸花青素的開發利用提供理論指導和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸（冷凍貯藏，遼寧華益農業有限公司）。

矢車菊素-3-O-半乳糖糖苷等標準品（上海哈靈生物技術有限公司）；HPD-450、X-5、AB-8、HPD-100型大孔吸附樹脂（國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（天津市科密歐化學試劑有限公司）；乙醇（天津市博迪化工股份有限公司）；鹽酸、乙酸鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、檸檬酸（分析純，天津市永大化學試劑有限公司）；甲醇、乙酸、乙腈（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

RE52CS型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；T-5型紫外分光光度計（北京普吸通用儀器有限公司）；BT-100-1L型蠕動泵（Longerpump公司）；LYO GT2-2型真空冷凍干燥機（SPK公司）；HZP-150型全溫振蕩培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；Agilent1200液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；高效液相-質譜儀，由Agilent1290液相色譜。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑果腺肋花楸花青素提取液的制備

參考孫陽昭等[10]所用方法，提取溶劑改為酸化甲醇溶液（V甲醇∶V水∶V鹽酸=80∶19∶1）。

1.3.2 花青素含量測定

以矢車菊素-3-O-半乳糖苷為標準品，pH示差法[11]測定樣品中花青素含量。

1.3.3 大孔樹脂的篩選

大孔樹脂HPD-450、X-5、AB-8和HPD-100的處理方法參照文獻[12-13]。

取經預處理的4種大孔吸附樹脂各2.0 g，置于4個150 mL具塞錐形瓶中，每瓶加入50 mL花青素粗提液，在30 ℃、110 r/min條件下振蕩24 h，過濾，測定濾液的花青素吸光度，按1.3.2方法計算濾液中的花青素，并按式（1）計算樹脂的吸附率。將上述吸附飽和的4種樹脂，分別加入50 mL pH 3.0、體積分數60%的乙醇溶液，同上述方法，按式（2）計算樹脂解吸率。

式中：A為吸附率，%；C0為起始溶液花青素質量濃度，mg/g；Ce為吸附平衡溶液質量濃度，mg/g；D為解吸率，%；V1為吸附溶液體積，mL；V2為解吸溶液體積，mL；C1為解吸液花青素質量濃度，mg/g。

1.3.4 大孔樹脂對花青素的靜態吸附動力學研究

稱取2.0 g經預處理的HPD-100大孔吸附樹脂，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL花青素粗提液，在30 ℃、110 r/min條件下吸附一定時間：吸附0~15 min期間，每隔5 min測定樣液吸光度；吸附15~105 min期間，每隔15 min測定吸光度；吸附105~195 min期間，每隔30 min測定吸光度；吸附195~325 min期間，每隔60 min測定吸光度，計算樣液的花青素含量，按式（3）計算樹脂的吸附量。分別采用準一級方程、準二級方程2個動力學模型[14]及顆粒內擴散模型[15]描述該樹脂對黑果腺肋花楸花青素的吸附情況和擴散機理。

式中：W為大孔樹脂吸附量，g；V1為吸附溶液體積，mL；C0為起始溶液花青素質量濃度，mg/g；Ce為吸附平衡溶液質量濃度，mg/g；Q1為花青素吸附量，mg/g。

1.3.5 大孔樹脂靜態吸附-解吸花青素試驗

（1）溫度對花青素吸附-解吸的影響

將50 mL pH 3.0的花青素溶液加入到預處理好的2.0 g大孔樹脂中，分別在20，30，40，50和60 ℃，轉數均為110 r/min條件下振蕩4.5 h，按式（3）計算大孔樹脂的吸附量。

（2）解吸液的體積分數對花青素解吸的影響

分別將50 mL體積分數30%，40%，50%，60%，70%和80%的酸性乙醇溶液，加入到吸附飽和的大孔樹脂中，在30 ℃、110 r/min條件下振蕩2.5 h，過濾，測定濾液中的花青素。

1.3.6 大孔樹脂動態吸附-解吸花青素試驗

將預處理過的12.5 g大孔樹脂濕法裝柱，以3 BV/h的速度將花青素粗提液上樣，每0.5 BV收集一次流出液并測定其吸光度，繪制泄露曲線。將已吸附飽和的大孔樹脂，用體積分數60%、pH 3.0的乙醇溶液以500 μL/min流速進行洗脫，每0.5 BV收集1次流出液，測定濾液中的花青素，繪制洗脫曲線。

1.4 HPLC-DAD分析

采用1200型號的液相色譜儀及二極管陣列檢測器，分析得出黑果腺肋花楸花青素單體的種類和含量，色譜操作條件參考國石磊[16]，樣品濃度2 mg/mL，柱溫30 ℃，進樣量25 μL，流速1 mL/min，檢測波長520 nm。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

4種大孔樹脂對黑果腺肋花楸花青素的吸附解吸附能力如表1所示。

表1 4種大孔樹脂對花青素吸附與解吸性能

由表1可知，HPD-100型的大孔樹脂對黑果腺肋花楸花青素吸附率達到90%以上，解吸率可達95%以上，選擇其用于黑果腺肋花楸花青素的純化。

2.2 HPD-100大孔樹脂對黑果腺肋花楸花青素的吸附動力學研究

2.2.1 靜態吸附曲線

HPD-100大孔樹脂對黑果腺肋花楸花青素的靜態吸附曲線如圖1所示。

圖1 HPD-100大孔樹脂對花青素的靜態吸附曲線

在吸附50 min內，HPD-100對花青素的吸附量增長迅速；50~175 min內吸附量增長速度逐漸降低；175 min后大孔樹脂吸附量趨于平衡，平衡吸附量為2.73 mg/g。

2.2.2 HPD-100大孔樹脂吸附花青素的動力學模型

HPD-100大孔樹脂吸附花青素的動力學模型參數見表2。

由表2可知，HPD-100大孔樹脂對黑果腺肋花楸花青素的吸附過程分別與準一級速率方程和準二級速率方程進行擬合，發現準二級速率方程的R2（0.991 8）大于準一級速率方程R2（0.939 8），說明該吸附過程屬于單一化學吸附過程。

表2 HPD-100型大孔樹脂吸附花青素動力學模型參數

2.2.3 HPD-100大孔樹脂吸附花青素顆粒擴散模型

HPD-100大孔樹脂吸附花青素粒子擴散模型參數見表3。

由表3可知，顆粒內擴散模型對整個吸附過程進行3個階段的擬合，第1個階段、第2個階段和第3階段分別屬于薄膜擴散、粒子內部及平衡吸附階段。通過對比3個階段的速率常數Ki，薄膜擴散為主要控速步驟。

表3 HPD-100型大孔樹脂吸附花青素粒子擴散模型參數

2.3 HPD-100大孔樹脂對花青素靜態吸附-解吸試驗結果

2.3.1 溫度對HPD-100大孔樹脂吸附-解吸效果的影響

由圖2可知，花青素吸附量隨著溫度升高逐漸下降，在50~60 ℃吸附量不再變化。原因在于在低溫條件下花青素比較穩定，隨著溫度升高，花青素逐漸開始分解。

圖2 溫度對大孔樹脂吸附花青素的影響

2.3.2 解吸液體積分數對HPD-100大孔樹脂解吸花青素的影響

由圖3可知，乙醇體積分數60%時，花青素洗脫效果最好。這是由于乙醇體積分數不同，乙醇溶液極性則不同，影響花青素和大孔樹脂之間的分子作用力，從而影響解吸效果[17]。

圖3 乙醇溶液體積分數對大孔樹脂解吸能力的影響

2.4 動態吸附-解吸試驗

由圖4可知，隨著上樣量增大，流出液中花青素含量逐漸增加。流出液中花青素吸光度達到上樣液花青素吸光值1/10時認為已出現泄露，即第8管（上樣量達到4 BV）上樣液時出現泄露。洗脫液用量至第21管時，洗脫液中花青素已完全洗脫。

圖4 HPD-100大孔樹脂對花青素吸附泄漏曲線及洗脫曲線

2.5 HPLC-DAD分析結果

黑果腺肋花楸花青素純化樣品在520 nm波長下的HPLC-DAD分析圖譜如圖5所示。

由圖5可知，黑果腺肋花楸花青素可分離出4種單體成分，占比依次是49.04%，41.17%，3.34%及6.45%。經進一步研究發現組分1為矢車菊素-3-半乳糖苷，組分2為矢車菊素-3-阿拉伯糖苷，組分4為矢車菊素-3-木糖苷，組分3待進一步鑒定[18-20]。

圖5 經HPD-100大孔樹脂純化后的花青素在520 nm下的HPLC圖

3 結論與討論

HPD-100大孔樹脂對黑果腺肋花楸花青素有良好的吸附效果，30 ℃條件下4.5 h可完全吸附；該樹脂對花青素的吸附過程符合準二級動力學模型描述，且以薄膜擴散為主；大孔樹脂純化花青素最佳條件為：花青素樣液pH 3.0、上樣量4 BV、上樣流速700 μL/min、解吸液pH 3.0、解吸量5 BV、解吸流速500 μL/min。經大孔樹脂純化后的花青素在520 nm的條件下分離出4種黑果腺肋花楸花青素單體成分，即矢車菊素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-木糖苷，還有一種待鑒定。

大孔樹脂純化花青素的機理是通過吸附和篩分2個機制共同作用實現。一方面，大孔樹脂對花青素的吸附屬于物理性吸附，吸附作用力為分子間引力，無需高活化能，吸附和解吸速度都較快。另一方面，樹脂的多孔結構又使其對分子量大小不同的物質具有篩選作用。HPD-100大孔樹脂為苯乙烯型非極性共聚體結構，適用于花青素這類弱極性的物質的純化分離，與極性較大的大孔樹脂相比，可在吸附花青素的同時，將一些水溶性多糖和氨基酸雜質濾去，且吸附過程不受無機鹽存在的影響。因此，HPD-100大孔樹脂在吸附純化花青素的同時，可以去除花青素提取物中的糖、有機酸、礦物質及其他水溶性雜質，為花青素的開發利用打下基礎。