動態高壓下大豆分離蛋白/多糖復合物表征

敬思群，王德萍，周苗苗，縱偉

1.韶關學院英東食品學院（韶關 512005）；2.新疆大學生命科學與技術學院（烏魯木齊 830046）；3.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，食品生產與安全河南省協同創新中心（鄭州 450002）

大豆粕經過低溫脫溶，得到一種新的蛋白類食品添加劑——大豆分離蛋白。大豆分離蛋白中蛋白質含量高達90%以上，富含人體所需的多種必須氨基酸，營養極其豐富[1-2]。大豆分離蛋白在起泡性、乳化性等功能特性方面特點突出，在食品加工生產中得到廣泛應用，成為一種可以替代動物蛋白的優質植物蛋白[3-4]。但是單一的大豆分離蛋白在成膜的機械性能和功能特性方面存在著很大的不足，需要通過適宜的手段進行改性。多糖是由多個單糖分子經過縮合、失水等過程形成，相對分子質量大，分子結構復雜，多糖按極性可分為三大類，即陰離子多糖（殼聚糖）、陽離子多糖（卡拉膠）和中性多糖（葡聚糖）。多糖是高分子化合物，含有大量的極性基團，在疏水性、溶解性、黏度、穩定性等方面具有其獨特的優勢，在蛋白質改性方面和食品生產加工應用極其廣泛。動態高壓微射流技術（DHPM）是一種較為前沿的高壓技術，結合高壓理論、流體力學理論和撞擊流理論，對流體物料進行強烈的剪切，瞬間壓力，高速的撞擊、高頻的振蕩等一系列聯合作用，對待處理物料進行均一化、微乳化、超微化等操作[5-7]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆分離蛋白（純度90%，食品級，哈高科大豆食品有限公司）；葡聚糖、卡拉膠、殼聚糖、三（羧甲基）氨基甲烷、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺、疊氮化鈉、十二烷基硫酸鈉（均為分析級）。

FPG128000動態超高壓微射流（英國SFP公司）；Nano-ZS90激光散射儀（英國Malern公司）；DYY-7C電泳儀電源（北京六一儀器廠）；JSM-6490LV掃描電鏡（日本JEOL公司）；Vertex70傅里葉紅外光譜儀（美國Bruker公司）；T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Chirascan圓二色光譜儀（英國應用光物理公司）；Vertex70傅里葉紅外光譜儀（美國Bruker公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

稱取適量大豆分離蛋白，加入去離子水，配制成質量濃度2.0 mg/mL的母液，用磁力攪拌器攪拌20 min使之充分溶解，使用膠體磨處理，將其細化及均勻分布，靜置4 ℃環境下水化過夜，得到大豆分離蛋白水溶液。

分別稱取適量的葡聚糖、殼聚糖和卡拉膠，加入去離子水，配制成質量濃度1.0 mg/mL的溶液，玻璃棒攪拌使其充分溶解，溶液中加入濃度0.02%的NaN3作為抑菌劑，防止細菌生長，靜置4 ℃冰箱水化過夜，分別得到葡聚糖、殼聚糖和卡拉膠水溶液。

1.2.2 大豆分離蛋白-多糖動態超高壓復合物的制備

將提前預處理好的大豆分離蛋白水溶液和多糖（分別為葡聚糖、殼聚糖和卡拉膠）水溶液按照2∶1比例進行混合，配置成大豆分離蛋白-多糖混合溶液。用玻璃棒攪拌使其混合均勻。采用PHB-3筆式pH計分別調節混合溶液的pH，大豆分離蛋白-葡聚糖混合溶液調至pH 7，大豆分離蛋白-殼聚糖混合溶液調節至pH 2，大豆分離蛋白-卡拉膠混合溶液調節至pH 10。采用動態高壓微射流均質機對3種大豆分離蛋白-多糖混合溶液進行處理。均質壓力120 MPa，循環處理2次（實驗室前期研究所得），將處理液離心20 min，離心速度8 000 r/min，收集上清液，將其分成2個部分，一部分直接進行測定，另一部分樣品冷凍干燥后進行后續測定。

1.2.3 SDS-PAGE分析

參考Mehrajfatema等[8]的方法進行SDS-PAGE試驗操作。用考馬斯亮藍R-250試劑對凝膠膠片進行蛋白質染色[9]。

1.2.4 紫外分光光度計波長掃描

將大豆分離蛋白、多糖（葡聚糖、殼聚糖、卡拉膠）單物質和大豆分離蛋白-多糖超高壓復合物分別配置成質量濃度0.1 mg/mL的溶液，用玻璃棒攪拌，使其充分溶解。采用紫外-可見分光光度計對待測樣品進行波長掃描，波長掃描范圍為190~500 nm，每個樣品平行測定3次。

1.2.5 接枝度的測定

參照齊寶坤等的方法[10]，采用三硝基苯磺酸（TNBS）法測定大豆分離蛋白-多糖動態超高壓復合物的接枝度。將處理好的待測樣品于340 nm處測定其吸光度A。每個樣品平行測定3次，取平均值進行計算。樣品接枝度的大小反應大豆分離蛋白與多糖接枝聚合的程度，值越大，表明接枝聚合程度越大，反之則越小。接枝度的計算如式（1）。

式中：A樣為大豆分離蛋白-多糖復合物吸光度；C樣為復合物中大豆分離蛋白質量濃度，mg/mL；A白為大豆分離蛋白吸光度；C白為大豆分離蛋白質量濃度，mg/mL。

1.2.6 傅里葉紅外光譜

參考Schestkowa等[11]的方法稍作改動。稱取2 mg大豆分離蛋白-多糖動態超高壓復合物粉末樣品，加入適量干燥的KBr進行壓片，將壓片放入測定室內進行測定。掃描范圍為4 000~400 cm-1，每個樣品的紅外圖譜為掃面32次的疊加圖。通過分析復合物紅外吸收光譜變化，表征大豆分離蛋白與多糖的相互作用對蛋白質二級結構的影響。

1.2.7 內置熒光光譜

參考Morales等[12]的方法進行測定。用5 mmol/L磷酸標準緩沖液（pH 7）配制待測液（蛋白質量濃度1 mg/mL），在激發波長334 nm處用熒光分光光度計對樣品進行發射波長掃描（350~500 nm），設置電壓600 mV，激發和發射狹縫寬5 nm，記錄各樣品的熒光光譜。通過蛋白質溶液熒光強度的大小表征蛋白質與多糖結合程度，熒光強度越弱，大豆分離蛋白與多糖結合程度越大，反之則越小。

1.2.8 圓二色光譜

參考Zhang等[13]的方法進行測定。用0.01 mol/L磷酸鹽標準緩沖液（pH 7）溶解一定量的待測樣品（蛋白質量濃度0.1 mg/mL），設定掃描波長190~260 nm，樣品池光程2 mm，分辨率0.5 nm，掃描速度100 nm/min，靈敏度100 mdeg/cm，試驗在室溫下進行。試驗值為3次掃描的平均值。

1.2.9 統計分析

試驗數據均采用SPSS 20.0軟件進行處理和分析，采用Origin 8.0和Prism 6.0繪制圖表，每次試驗均進行3次平行，取平均值，試驗結果以平均值±標準差的形式表示。

2 結果與討論

2.1 SDS-PAGE

采用聚丙烯酰胺電泳來分析大豆分離蛋白-多糖超高壓復合物在形成過程中亞基的變化及相對分子質量的變化情況。圖中1條帶為大豆分離蛋白，2~4條帶分別為葡聚糖、殼聚糖和卡拉膠，5~7條帶為大豆分離蛋白-葡聚糖、大豆分離蛋白-殼聚糖和大豆蛋白-卡拉膠復合物。圖譜結果表明，大豆分離蛋白條帶是由β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白各個亞基所組成。經過DHPM處理得到的大豆分離蛋白-多糖復合物在相對分子質量70~100 kDa的蛋白含量減少，在相對分子質量20~25 kDa出現新的條帶，表明DHPM處理大豆分離蛋白和多糖，使得二者之間相互作用，形成復合物。

圖1 大豆分離蛋白-多糖復合物SDS-PAGE圖

2.2 全波長掃描光譜分析

多肽鏈中的一切原子單鍵的旋轉產生空間排布的變化構成蛋白質的構象變化。蛋白質中氨基酸的微環境在一定程度上與光譜特征相關，因此用光譜特征的變化來反映蛋白質構象的變化情況。由圖2可以看出，單純的大豆分離蛋白在紫外光譜區域具有2個特征的蛋白質吸收帶，其特征峰的大致位置分別在220 nm和280 nm附近。220 nm處的特征吸收峰主要是大豆分離蛋白肽鍵上的羰基的n-π*電子躍遷所引起；208 nm處的特征吸收峰是大豆分離蛋白分子中色氨酸和酪氨酸殘基的芳香雜環π-π*和n-π*電子躍遷所引起。大豆分離蛋白220 nm處吸收峰強度遠遠大于280 nm處吸收峰強度。隨著多糖加入，2個特征峰均呈現減弱趨勢，表現為減色效應。220 nm處的吸收光譜減色效應更為明顯，表明多糖的引入與蛋白質肽鍵上的羰基發生部分結合，使得復合物在220 nm處吸收峰強度減弱；同時，吸收峰的峰位發生藍移（向短波長方向移動），也說明大豆分離蛋白分子的結構發生一定改變。

圖2 大豆分離蛋白-多糖復合物紫外光譜圖

2.3 接枝度（DG）的測定

糖基化反應是基于美拉德反應過程中發生的Amadori重排過程，使蛋白質分子中游離氨基基團連接到多糖分子的還原端。試驗采用接枝度表征體系游離氨基的變化情況，從而表征大豆分離蛋白與多糖在動態高壓微射流的作用下結合的情況。圖3是大豆分離蛋白分別與葡聚糖、殼聚糖和卡拉膠經過超高壓處理所形成復合物溶液的接枝度變化。3種復合物溶液接枝度與對照組相比較，顯著性增加（p＜0.01）。這是由于動態高壓微射流的處理產生熱效應和空穴作用，蛋白質分子結構變得松散，溶解性增加，使得蛋白質可用自由氨基的數目顯著增加，增加大豆分離蛋白與多糖分子的碰撞幾率，提高大豆分離蛋白-多糖的接枝度，進而反映出大豆分離蛋白和多糖在超高壓作用下結合的程度。

圖3 大豆分離蛋白-多糖復合物接枝度的測定

2.4 大豆分離蛋白-多糖超高壓復合物傅里葉紅外光譜分析

大豆分離蛋白與多糖通過動態高壓微射流處理形成復合物，使復合物的紅外光譜與大豆分離蛋白單物質相比產生影響。如圖4所示，大豆分離蛋白與多糖形成的復合物的特殊吸收峰的峰寬明顯增大，主要是由于多糖與蛋白結合后其羥基含量增加。N—H伸縮振動峰位置發生不同方向偏移，這是由于大豆分離蛋白與多糖經過高壓處理后，大豆分離蛋白中的氫鍵發生不同變化。酰胺I帶在1 636 cm-1吸收峰變強，并且譜帶的最高點發生遷移，酰胺基譜帶向低波數遷移（藍移）說明β-折疊增多。酰胺基譜帶的變化說明不同多糖與大豆分離蛋白復合，對蛋白質二級結構的影響程度各不相同。

圖4 大豆分離蛋白-多糖復合物紅外光譜圖

2.5 內置熒光光譜分析

由于蛋白質中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，這些基團是所有天然氨基酸中僅有的發熒光基團的氨基酸，是蛋白質內源熒光的主要來源。蛋白質溶液的熒光淬滅就是指溶液中淬滅分子與熒光物質分子之間發生相互作用，導致熒光物質的熒光量子效率降低或者激發態壽命縮短，進而導致溶液熒光強度降低。由圖5可知，在存在多糖的條件下，通過動態超高壓處理形成的復合物溶液中，熒光強度均明顯減弱，這是由于淬滅體（多糖）和熒光發光體（SPI）之間通過超高壓的作用相互碰撞，形成不發光的配合物，從而導致熒光物質熒光強度降低的過程。復合物溶液的最大發射波長發生位移變化，向低波長方向移動（藍移），也證明大豆分離蛋白-多糖在超高壓的作用下，環境的疏水性增強，蛋白質構象發生變化，形成的復合物趨向于折疊狀態。

圖5 大豆分離蛋白-多糖復合物內置熒光光譜圖

2.6 圓二色光譜分析

蛋白質中生色基團主要是由肽鏈中的肽鍵、芳香氨基酸殘基、二硫鍵等。圓二色譜的遠紫外區段波長為190~250 nm，主要的生色團為肽鍵。參照待測蛋白質或者多肽的遠紫外區圓二色譜圖，可以推測待測蛋白質或者肽鍵相應的二級結構信息，進而揭示蛋白質或者肽鍵的二級結構。由圖6可知，大豆分離蛋白在185 nm和208 nm處左右有2個負的肩峰，經過DHPM處理，形成的大豆分離蛋白-多糖復合物在208 nm處附近呈現出正峰，在222 nm處附近出現負峰。由表1可以看出，多糖與大豆分離蛋白通過超高壓結合，導致β-折疊和無規卷曲均發生變化，SPI-G、SPI-CH和SPI-CA這3種復合物β-折疊和無規卷曲含量均增多（p＜0.05），二級結構發生改變。這可能歸因于在動態超高壓處理下，大豆分離蛋白由空化、剪切、高速撞擊和高頻振動引起大豆分離蛋白發生折疊，所以形成的復合物二級結構也發生變化。

表1 不同壓力下大豆分離蛋白二級結構組分含量

圖6 大豆分離蛋白-多糖復合物圓二色光譜圖

3 結論

SDS-PAGE試驗結果表明，DHPM處理大豆分離蛋白和多糖，出現新條帶，使得大豆分離蛋白相對分子質量變小，形成相對分子質量較小的復合物。

結合紫外光譜、接枝度、傅里葉紅外光譜、內置熒光光譜和圓二色光譜的分析結果可知，大豆分離蛋白與多糖（G、CH和CA）在動態超高壓作用下形成的復合物，紫外光譜2個特征峰均呈現減弱趨勢，表現為減色效應，吸收峰的峰位發生藍移；與對照組（SPI）相比較，溶液接枝度顯著增加；復合物紅外光譜特殊吸收峰的峰寬明顯增大，酰胺I帶在1 636 cm-1吸收峰變強，并且譜帶的最高點發生藍移；熒光光譜顯示復合物熒光強度均明顯減弱，最大發射波長發生藍移；圓二色光譜顯示多糖與大豆分離蛋白通過超高壓結合，導致β-折疊和無規卷曲均發生變化，二級結構發生改變。試驗結果顯示大豆分離蛋白與多糖在超高壓作用下有效結合，形成復合物。