檸檬酸鉀與TG酶對牛乳酸凝膠形成的協同作用

高飛，楊暢, ，李洪亮,

1.蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司（北京 101100）；2.內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司（呼和浩特 011500）；3.蒙牛乳業（北京）有限責任公司（北京 101100）

凝固型酸奶以其獨特的風味、細膩的質地和較高的營養價值而深受人們的喜愛[1-2]。但是凝固型酸奶在貯藏和運輸過程中存在質地不穩定現象，突出表現為黏度降低、乳清析出和外觀變粗糙等宏觀現象[3]，極大地影響產品的感官性質和消費者的可接受性[4-5]。

乳蛋白是凝固型酸奶質地最重要的構筑單元[6]，其包括乳清蛋白和酪蛋白[6-7]，其中酪蛋白在牛乳中是以直徑約150 nm膠束形式存在[6,8]。在菌種的作用下，酪蛋白通過非共價鍵形成的三維凝膠網絡結構對酸奶質地的穩定性起決定作用[9-10]。TG酶是食品工業中常用的交聯劑[11-12]，可通過促進酪蛋白分子間的共價交聯實現如凝膠空間網絡結構的調控，從而提高凝膠的質地特性[13-14]。然而，由于酪蛋白膠束較為致密的內部結構，TG酶難以進入膠束內部進行蛋白間共價交聯[15]，因此TG酶處理無法形成交聯度更高的凝膠網絡結構，所以酸奶的凝膠強度較低與乳清析出等缺陷無法得到根本改善。

已有研究證實，鈣離子的螯合劑（如檸檬酸鹽、磷酸鹽）可以使酪蛋白膠束分解為粒徑更小的酪蛋白聚集體[16-17]，這將增加TG酶對酪蛋白的作用位點，因而可能增加酪蛋白的交聯度，從而進一步改善酸奶凝膠在儲存和運輸過程中的穩定性。但是目前尚無關于鈣螯合劑和TG酶協同處理來改善脫脂酸乳凝膠質地特性的報道。此次試驗以脫脂粉復原乳為原料，以檸檬酸鉀作為鈣離子螯合劑，研究了檸檬酸鉀和TG酶協同處理對脫脂酸乳凝膠質地和微觀特性的影響。此次研究將為提高脫脂酸乳凝膠產品的穩定性和感官特性提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳，由三河福成生物科技有限公司提供，蛋白質含量為3.0%，于4 ℃貯藏；檸檬酸鉀，廣東西隴科學股份有限公司；TG酶（酶活200 U/g），德國C &P有限責任公司；復配菌種（W保加利亞乳桿菌∶W嗜熱鏈球菌=6∶4），美國Dupont公司。

1.2 儀器與設備

CT6E日立臺式離心機（長沙科美分析儀器有限公司）；Nano ZS納米粒徑分析儀（英國Malvern公司）；TA-XT+質構儀（英國Stable Micro Systems公司）；MCR302流變儀（奧地利Anton-Paar公司）；S-3000N冷凍掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 檸檬酸鉀處理脫脂乳

將檸檬酸鉀加到脫脂乳中，使其濃度分別達到0，5，10，20，30，40和50 mmol/L。用0.5 mol/L的HCl將各組pH調至6.6。將已分散完全的TG酶溶液按10 U/g乳蛋白的比例分別添加到各組中，25 ℃下磁力攪拌5 min使其分散，然后置于43 ℃的恒溫水浴鍋中1 h，使乳蛋白和TG酶充分作用。

1.3.2 酸乳樣品的制備

將復配菌種按照0.2 DCU/kg添加到1.3.1中各組樣品中，置于43 ℃的恒溫箱中6 h，最后將樣品于4 ℃保存。

1.3.3 樣品測試

1.3.3.1 粒徑測定

將1.3.1中TG酶處理前的樣品用25 ℃的超純水稀釋500倍，利用粒徑分析儀測定各組樣品的粒徑分布。測試時，樣品的環境溫度為25 ℃，動態光散射光源的散射角度為90°。

1.3.3.2 凝膠的流變學性能測定

凝膠的流變特性采用MCR302流變儀進行測定，將發酵菌種添加到脫脂乳后，迅速轉移到流變儀樣品測試的圓筒中，樣品表面平鋪一層厚度為3 mm左右的植物油，以防止樣品水分的蒸發。測試時的振蕩頻率設定為0.1 Hz，振幅設定為1%，以確保測試所得的數據處于線性黏彈區，測試溫度保持在43 ℃，凝膠時間段選取儲能模量G’≥1 Pa的區域[18]。

1.3.3.3 凝膠強度的測定

將1.3.2中的樣品從4 ℃的冰箱取出后，在25 ℃的室溫下放置2 h，待溫度恒定后，置于質構儀下方，選擇直徑10 mm的探頭，以60 mm/min的速度從接觸樣品表面后勻速下降20 mm，記錄凝膠強度隨下降時間的變化，將凝膠破裂點的數值作為凝膠強度[19]。

1.3.3.4 凝膠持水力測定

按照1.3.2的方法制備樣品，冷卻至室溫后，將樣品置于臺式離心機中進行離心（2 800g，5 min）。離心后，小心去除水層，按式（1）計算持水力（WHC）[20]。

式中：M0為離心管的質量，g；M1為離心去除水層后樣品和離心管的總質量，g；M2為樣品質量，g[18]。

1.3.4 凝膠微觀結構的表征方法

微觀結構的表征采用S-3000N冷凍電鏡掃描儀，樣品固定在載樣平臺后，在-180 ℃的液氮中迅速冷凍，并在-85 ℃下升華35 min，升華結束后，在樣品表面進行噴金處理，噴金時間為90 s，噴金后，對樣品表面進行實時觀察[21]。

2 結果與分析

2.1 檸檬酸鉀對脫脂乳顆粒直徑的影響

檸檬酸鉀處理后脫脂乳顆粒直徑的影響見圖1。檸檬酸鉀的濃度越高，脫脂乳中顆粒的尺寸越小，表明檸檬酸鉀能有效降低脫脂乳體系中酪蛋白膠束的粒徑。酪蛋白膠束是由4種蛋白單體（αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白），以及磷酸鈣相互結合而成的復合物[21]。其中磷酸鈣在膠束中的主要作用是對各種蛋白單體進行非共價交聯，以膠態存在，也稱膠態磷酸鈣[22]。而檸檬酸根的鈣離子螯合能力顯著高于磷酸根[23]。因此檸檬酸根能有效螯合酪蛋白膠束中的鈣離子，導致膠態磷酸鈣的解離，從而導致膠束中各蛋白之間的連接程度降低，直觀表現是脫脂乳中顆粒粒徑顯著減小。

圖1 不同濃度的檸檬酸鉀處理對脫脂乳中顆粒直徑的影響

2.2 檸檬酸鉀對脫脂酸奶流變學特性的影響

在TG酶濃度相同的條件下，不同濃度的檸檬酸鉀處理對脫脂酸乳的儲能模量G’隨時間變化的影響見圖2。隨著凝膠時間的延長，各組的儲能模量G’均呈現出逐漸上升的趨勢。同時也發現，隨著檸檬酸鉀濃度的增加，儲能模量G’從不添加檸檬酸鉀時的（16.28±2.13）Pa到檸檬酸鉀濃度為40 mmol/L時的（108.14±5.58）Pa，儲能模量提高了7倍。通過粒徑的測試結果可以看出，檸檬酸鉀可以促使酪蛋白膠束的解離，使膠束內部的蛋白單體釋放出來，暴露出更多的酶促反應結合位點[24]，從而增加凝膠網絡中共價鍵的數量與強度，致使儲能模量增加[25]。隨著檸檬酸鉀濃度的繼續增大，脫脂乳無法形成凝膠，可能是由于檸檬酸根結合了大量的氫離子，使體系的pH無法達到酪蛋白的等電點。

圖2 不同濃度檸檬酸鉀處理對脫脂酸乳彈性模量隨時間變化的影響

2.3 檸檬酸鉀對脫脂酸奶凝膠強度的影響

在TG酶濃度一定的條件下，不同濃度的檸檬酸鉀處理對脫脂酸奶凝膠強度的影響見圖3。不經過檸檬酸鉀處理且無TG酶存在時所形成的凝膠強度最低，表明TG酶能增加體系的凝膠強度。在0~30 mmol/L范圍內，隨著檸檬酸鉀濃度的增加，凝膠強度呈顯著的增加趨勢；繼續增加檸檬酸鉀的濃度，凝膠強度未出現顯著的變化。經過檸檬酸鉀處理后脫脂乳中顆粒的尺寸更小，能有效地促進TG酶與酪蛋白的相互作用，從而增加酪蛋白的共價交聯程度，形成更為穩定的凝膠網絡結構。

圖3 檸檬酸鉀處理對脫脂酸乳凝膠強度的影響

2.4 凝膠持水力測定結果與分析

在TG酶濃度一定的條件下，不同濃度的檸檬酸鉀處理對脫脂酸乳凝膠持水力的影響見圖4。與空白組相比，僅添加TG酶的組別，持水能力雖有所提高，但無法有效地抑制乳清析出；當檸檬酸鉀濃度大于20 mmol/L時，凝膠的持水力顯著上升，之后基本保持平穩的狀態。這是因為經較高濃度的檸檬酸鉀處理，脫脂乳體系中的酪蛋白膠束得到充分的解離，酪蛋白與TG酶的結合位點增多，水分不易從凝膠網絡結構中脫除；而不經過檸檬酸鉀解離或解離程度不夠，形成的凝膠網絡結構就比較松散，在離心的作用下更容易失水而變得不穩定。

圖4 不同濃度檸檬酸鉀處理對脫脂酸乳凝膠持水力的影響

2.5 凝膠微觀結構分析

不同濃度的檸檬酸鉀處理后的各試驗組脫脂酸乳凝膠的微觀結構見圖5。圖5（A）表明在無檸檬酸鉀和無TG酶的條件下形成的脫脂酸乳凝膠中幾乎找不到規則的網絡，表明僅依靠酪蛋白分子間的疏水作用和氫鍵等非共價鍵形成的酸凝膠結構是不穩定的；圖5（B~F）是在TG酶存在的條件下，不同檸檬酸鉀處理組形成的脫脂酸乳凝膠結構的微觀結構圖。可以看出，隨著檸檬酸鉀濃度的增加，形成的三維凝膠的空隙致密程度呈明顯的增加現象，凝膠網格之間斷裂的數量顯著降低，表明在TG酶存在的條件下，隨著檸檬酸濃度的增加，形成的脫脂酸乳凝膠的穩定性呈顯著的增加趨勢。

圖5 不同檸檬酸鉀濃度處理后脫脂乳凝膠體系微觀結構的掃描電鏡圖

3 結論

此次試驗以TG酶交聯的脫脂乳凝膠作為研究對象，研究了檸檬酸鉀的濃度對凝膠質構特性的影響。結果表明：檸檬酸鉀的濃度越高，脫脂酸乳的強度越大，持水能力越強，穩定性越高。檸檬酸鉀改善脫脂酸乳質構的機制是：檸檬酸根使脫脂乳中膠態磷酸鈣解離，促使酪蛋白膠束分解，增加了酪蛋白與TG酶發生共價交聯作用的位點，乳凝膠形成后，由于共價交聯位點數量的增加，凝膠網絡結構更為致密，穩定性顯著提高，改善了凝膠的質構特性。