山楂食用酵素抗氧化及對脂肪酶活性

聶俊蓮，蘇嘉燁，張存莉

1.西北農林科技大學化學與藥學院（楊凌 712100）；2.陜西五丁生物科技有限公司，漢中市食用植物酵素研發與檢測重點實驗室（寧強 724400）

食用植物酵素是以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分可供人類食用的酵素產品[1]，2019年被國家發改委列入《產業結構調整指導目錄》鼓勵類產業。但目前社會上對酵素產品爭議較大，褒貶不一。山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）為薔薇科植物山里紅或山楂的干燥成熟果實，其含有豐富的黃酮、多糖、酚和有機酸等化合物，具有顯著的降脂減肥、降血糖、抗動脈粥樣硬化、抗氧化等作用[2-6]，目前國內對山楂酵素的研究多集中于發酵工藝研究[7-9]。因此，此次試驗以山楂為原料，采用多菌種混合發酵，探究山楂發酵前后的抗氧化和對胰脂肪酶的活性作用，以期為山楂資源的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂，市售；葡萄酒高活性干酵母，安琪酵母有限公司產品；乳酸菌（植物乳桿菌），臺灣亞芯生物科技有限公司；醋酸菌，滬釀1.01號醋酸菌，上海佳民釀造食品有限公司；纖維素酶，廣東永信食品配料有限公司；脂肪酶、磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、DPPH（分析純）、ABTS（分析純）、總抗氧化能力檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；水楊酸（分析純），天津市天力化學試劑有限公司；七水合硫酸亞鐵（分析純），廣東光華科技股份有限公司；橄欖油（分析純）、聚乙烯醇（分析純）、95%乙醇（分析純），上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1801型紫外分光光度計（日本島津公司）；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；DHP-9052B型電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；BPG-9056A型精密鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；ME204E/02型精密和分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗材料

山楂酵素：取500 g山楂，按適當比例加水，取纖維素酶酶解后的山楂漿，將活化好的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌先后接種到待發酵液中，發酵90 d左右。

1.3.2 有效成分的測定

1.3.2.1 黃酮的測定

以空白試劑為對照，在510 nm波長處測定不同濃度蘆丁標準液吸光度，制定標準曲線。蘆丁濃度X與吸光度Y間的回歸方程為Y=11.391X+0.006 4，相關系數為0.999 9。

精密吸取2.0 mL樣品溶液，置于10 mL具塞試管中，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，反應6 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，反應6 min，再加4 mL 1 mol/L NaOH溶液終止反應，最后加入50%乙醇至10 mL，搖勻，以空白試劑為對照，在510 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線計算出樣品中總黃酮的濃度[10]。

1.3.2.2 粗多糖的測定

以空白試劑為對照，在620 nm波長處測定不同濃度葡萄糖吸光度。以吸光度（A）為縱坐標Y，以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標X，做標準曲線，得到回歸方程Y=38.658X-0.002 4，相關系數為0.999 6。

精密吸取1.0 mL樣品溶液，置于10 mL具塞試管中，加入4 mL蒽酮試劑（0.2 g蒽酮溶于100 mL濃H2SO4），迅速置于冰水浴中冷卻。待各管加完后一起浸于沸水中煮沸10 min，取出后用流水冷卻，室溫放置10 min，搖勻，以空白試劑為對照，在620 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線計算出樣品中多糖的含量[11]。

1.3.2.3 多酚的測定

按照GB/T 8313—2018[12]中規定的茶多酚的檢測方法測定。以空白試劑為對照，在765 nm波長處測定不同濃度沒食子酸標準液吸光度，以吸光度（A）為縱坐標Y，以對照品取樣量（mg）為橫坐標X，進行線性回歸，得到回歸方程Y=0.001 6X+0.007 6，相關系數為0.999 1。

精密吸取1 mL樣品溶液，置于10 mL具塞試管中，加5 mL 10%福林酚試劑，搖勻。反應3~8 min內，加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，搖勻，室溫下放置60 min，以空白試劑為對照，在765 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線計算出樣品中多酚的濃度。

1.3.2.4 總酸的測定

按GB/T 12456—2008[13]酸堿滴定法測定發酵液中總酸濃度。

1.3.3 抗氧化活性研究

1.3.3.1 DPPH自由基清除率的測定

參考You等[14]的方法，準確配制4×10-4mol/L的DPPH溶液，置于冰箱內冷凍避光保存。將體積分數100%的山楂果醋，分別按5%，10%，15%，20%，25%和30%的體積分數加水稀釋，制備不同體積濃度的樣液。取0.5 mL樣液，準確加入3 mL DPPH溶液，充分混勻后在避光的環境下放置30 min后，在517 nm條件下測定吸光度Ai。同時測定0.5 mL樣液與3 mL無水乙醇混合液的吸光度Aj，以及無水乙醇0.5 mL與3 mL DPPH溶液混合液的吸光度A0。按式（1）計算。

標準曲線的繪制：依次配制50，100，150，200和250 μg/mL的VC標準溶液，按照上述樣品測定方法測定吸光度，以VC濃度為橫坐標，清除率縱坐標繪制標準曲線，VC質量濃度X與清除率Y間的回歸方程為Y=0.003 8X+0.035 8，相關系數為0.991 4。

1.3.3.2 ABTS自由基清除率的測定

參考閆亞美等[15]的方法，準確稱取0.038 4 g的ABTS自由基和0.013 4 g的過硫酸鉀樣品，分別用純水定容至10 mL；之后按照1∶1混合均勻避光保存12 h，形成ABTS+工作液，使用前純水稀釋10倍。將體積分數100%的山楂果醋，分別按5%，10%，15%，20%，25%和30%的體積濃度加水稀釋，制備不同體積濃度的樣液。在樣品管中加入200 μL稀釋好的樣液和3 mL ABTS+溶液靜置6 min，在734 nm處測定溶液的吸光度Ai。同時測定200 μL樣品液和3 mL超純水的吸光度Aj，以及200 μL蒸餾水和3 mL ABTS混合溶液的吸光度A0。按式（2）計算。

標準曲線的繪制：依次配制50，100，150，200和250 μg/mL的VC標準液，按照上述樣品測定方法測定A值，以VC濃度為橫坐標，清除率為縱坐標繪制標準曲線，VC質量濃度X與清除率Y間的回歸方程為Y=0.004X-0.033 6，相關系數為0.995 8。

1.3.3.3 總抗氧化能力測定

依據北京索萊寶科技有限公司總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒說明書，稍加改動，首先將體積分數100%的山楂果醋，分別按5%，10%，15%，20%，25%和30%的體積濃度加水稀釋，制備不同體積濃度的樣液。按照試劑盒規定的方法測定593 nm處的吸光度，計算ΔA=A標準-A空白。以Fe2+濃度為橫坐標X，ΔA為縱坐標Y繪制標準曲線，得到線性方程Y=11.186X-0.080 2，將A樣品帶入方程求得X（μmol/mL）。則總抗氧化能力（μmol/mL）按式（3）計算。

式中：X為Fe2+濃度，μmol/mL；V反總為反應總體積，1.02 mL；V樣為反應中樣本體積，0.03 mL。

1.3.4 胰脂肪酶活性測定

參考祁靜等[16]的方法，在干凈錐形瓶中準確移入8 mL橄欖油乳液、5 mL 0.1 mol/L pH 7.2的PBS緩沖液，然后分別準確移入3 mL提前調至pH 7.2的山楂果醋，置于磁力攪拌器上充分攪拌均勻，最后準確移入1 mL 0.20 mg/mL的胰脂肪酶液，再次充分攪拌均勻。將上述反應液置于37 ℃下的恒溫培養振蕩器中反應1.5 h，然后加入15 mL 95%乙醇終止酶反應。于反應液中滴加2滴酚酞指示劑，使用0.02 mol/L NaOH滴定體系中產生的脂肪酸量。

對胰脂肪酶的活性進行檢測，平行試驗3次，胰脂肪酶的酶活計算采用胰脂肪酶的活力測定公式（4），胰脂肪酶的活性抑制率計算公式如式（5）所示。

式中：X為樣品的酶活，μmol/（min·mg）；V1為滴定樣品時消耗的NaOH標準溶液的體積，mL；V2為滴定空白時消耗的NaOH標準溶液的體積，mL；CNaOH為NaOH標準溶液的濃度，mol/L；t為反應時間，min；C酶為胰脂肪酶的質量濃度，mg/mL；V酶為胰脂肪酶的添加體積，mL。

式中：抑制率為胰脂肪酶的活性抑制率，%；X1為對照組酶活，μmol/（min·mg）；X2為樣品組酶活，μmol/（min·mg）。

2 結果與分析

2.1 有效成分變化

山楂發酵前后有效成分變化如圖1所示。

圖1 山楂發酵前后有效成分含量變化

由圖1可知：山楂原液中黃酮、多酚、粗多糖和總酸質量濃度分別為4.5，4.7，14.6和10.4 mg/mL；山楂酵素中它們的質量分數分別為7.4，6.7，13.7和36 mg/mL，其中黃酮、多酚、總酸濃度分別提高了64%，43%和246%。

2.2 抗氧化性結果分析

將不同體積分數（5%~30%）的山楂原液和山楂酵素進行清除DPPH、ABTS清除率和總抗氧化能力進行對比，結果如圖2所示。

由圖2（A）可知，不同體積分數山楂原液和酵素對DPPH清除率均呈現先上升后逐漸平緩的趨勢，當體積分數為5%和10%時，酵素的清除率高于原液，當體積分數為30%時二者的清除率相差不大，在95%和97%左右，原液和酵素分別相當于241和246 μg/mL VC的清除作用。說明山楂本身含有的有效成分和微生物發酵產生的代謝物對DPPH自由基的清除具有顯著作用，經發酵后清除作用增強，隨著體積分數增加，兩者清除作用趨于一致，由此可以看出發酵引起的成分變化對DPPH自由基影響不大。

由圖2（B）可知，體積分數在5%~30%區間內，山楂原液對ABTS自由基的清除率低于酵素，原液在25%~30%區間逐漸平穩，清除率在85%左右，而酵素在20%時對ABTS的清除率達到最大值（99%左右），原液和酵素分別相當于221和250 μg/mL左右VC的清除作用。說明微生物發酵后引起營養成分變化，產生的代謝物在清除ABTS自由基方面優于原液，且不會隨酵素體積分數增加而變化。

由圖2（C）可知，在5%~30%范圍內，山楂原液和酵素總抗氧化能力整體均呈逐漸上升趨勢，且酵素的總抗氧化能力明顯高于原液。當體積分數為30%時，山楂原液和酵素的總抗氧化性分別為6.9和8.8 μmol/mL，酵素的總抗氧化性高于原液。說明微生物生長代謝產生的成分變化對總抗氧化能力T-AOC值影響顯著，山楂經過多菌種發酵更有利于山楂中抗氧化活性成分的保持且隨著體積分數的增加對總抗氧化能力的影響逐漸增大。

圖2 山楂原液和山楂酵素對DPPH自由基（A）、ABTS自由基（B）清除率和總抗氧化能力（C）

2.3 山楂酵素對脂肪酶活性測定結果分析

山楂原液和山楂酵素對脂肪酶活性研究如圖3所示。

圖3 山楂酵素和山楂原液對脂肪酶抑制率

由圖3可知，山楂酵素和原液均對脂肪酶有抑制作用，山楂酵素、原液對脂肪酶的抑制率分別為71.2%和64.7%，酵素的抑制率高于原液，說明經混合菌種發酵后，產生的成分變化和代謝物能夠促進對脂肪酶的抑制作用，提高對脂肪酶的抑制率。

3 結論與討論

研究結果表明：山楂酵素中黃酮、多酚、總酸濃度分別比原液提高了64%，43%和246%，對DPPH、ABTS自由基清除率、總抗氧化能力和體外對脂肪酶抑制率分別提高了2%，16.5%，27.5%和246%，差異顯著，表明山楂酵素的抗氧化能力和對脂肪酶抑制活性優于山楂原液，與相關研究結論一致[17-19]。

酵素產品中主要有機酸為乳酸、乙酸、蘋果酸等[20]，山楂酵素總酸含量大幅上升的原因是體系中的酵母菌、乳酸菌利用可發酵的碳水化合物，轉化成乙醇和乳酸，醋酸菌利用體系中的乙醇將其轉化成乙酸；另外山楂本身也含有大量有機酸，隨著發酵時間延長，有機酸逐漸溶出；山楂酵素黃酮類物質含量上升的原因，可能是由于：①酵母菌發酵過程中能產生果膠酶；②前處理過程中加入纖維素酶，二者可破壞植物細胞壁，促進細胞內黃酮類物質溶出[21-22]。酚類化合物含量上升，可能是由于乳酸菌產生的酶及有機酸能增加發酵液中的總酚含量，酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的混菌體系在飲料發酵過程中可將大分子酚類物質降解成小分子酚類物質[23-24]；山楂發酵后，抗氧化活性明顯增強，可能是黃酮和多酚類物質含量增加的原因，與相關研究一致[25]。對脂肪酶活性抑制增加，可能是體系中的黃酮類以及乙酸[26]、乳酸[27]等物質含量增加所致，因為三者均具有顯著調節血脂的功效[28]。相比山楂原液，山楂酵素的抗氧化能力增強，可以降低氧化應激反應，從而對肥胖、高血脂和糖尿病等代謝綜合征產生一定防治作用；抑制胰脂肪酶活性，可有效抑制脂質代謝過程，降低人體對膳食脂肪的消化率和代謝產物的吸收率，從而控制血漿脂原濃度的升高，達到降血脂的功效[17]，這可能也就是2019年國家將食用酵素列為《產業結構調整指導目錄》鼓勵類產業原因之一。