蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖的穩定性

陳海燕，程仕群，胡騰鑫，酈明浩

廣東產品質量監督檢驗研究院（佛山 528300）

蜜蜂在我國有著悠久的養殖歷史，蜜蜂生產出的蜂蜜是人們日常生活中主動攝入糖的主要來源，同時又可以用于食物保存，因此在很早以前就被廣泛使用[1-2]。蜂蜜作為治療和保健食品，已有悠久的歷史[3]。1 800年前，張仲景將蜂蜜用于治療多種疾病，明代的李時珍在《本草綱目》中列舉用蜂蜜治病的處方20余處[4]。現代醫學證明，蜂蜜外用可以治療凍傷、凍瘡[5]，護唇及治療口腔疾病、舒緩干燥，治療皸裂、燒燙傷、蚊蟲叮咬、皮膚潰瘍、鼻炎[6]及外傷，養顏美容等[7-8]；蜂蜜內服可以緩解痛經[9]、治療便秘和調節胃腸功能[10-12]、治療支氣管炎[13]、咳嗽[14]等。蜂蜜因多用途深受消費者喜歡，但天然蜂蜜成本高，部分不良商家以次充好來欺騙消費者牟取暴利[15-16]，天然蜂蜜中含有的化學物質主要為糖類，占蜂蜜質量的60~80 g/100 g[17-18]，蔗糖含量不得超過5 g/100 g，而部分不良商家主要是摻入糖類物質來冒充天然蜂蜜，因此準確測定蜂蜜中糖含量尤為重要[19-20]。

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖的檢測方法主要是GB 5009.8—2016《食品安全國家標準 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》高效液相色譜法（high performance liquid chromatography HPLC）。按照GB 14963—2011《食品安全國家標準 蜂蜜》規定果糖和葡萄糖含量≥60 g/100 g，蔗糖含量≤5 g/100 g（野桂花蜜≤10 g/100 g），根據檢測經驗，不少蜂蜜產品果糖和葡萄糖含量在60±10 g/100 g，處于臨界值附近，而對于果糖、葡萄糖、蔗糖這3種物質在蜂蜜中的穩定性研究尚少。試驗從溫度、水浴時間、pH等樣品前處理研究3種糖在蜂蜜前處理過程中及樣品處理后不同儲存時間的穩定性，為試驗過程中選取最優穩定性條件及最長儲存時間進行相關物質測定時提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

果糖（99.70%，德國DR Ehrenstorfer公司）；葡萄糖（99.7%，美國TM Standard公司）；蔗糖（99.9%，中國北京壇墨質檢科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）；鹽酸（分析純，廣州化學試劑廠）；氫氧化鈉（分析純，天津科密歐化學試劑有限公司）。

試樣來自各大商超及農貿市場。

LC-20 AT高效液相色譜儀，配蒸發光散射檢測器（日本島津公司）；JJ500Y電子天平（常熟市金羊砝碼儀器有限公司）；EYELA SB-1100旋轉蒸發儀（日本東京理化公司）；IKA MS3漩渦混合器（德國IKA公司）；JP-0600超聲波清洗機（廣州吉普超聲波電子設備有限公司）；Milli-Q超純水純化系統（美國Millipore公司）；0.22 μm水系濾膜（天津津滕公司）；HH-8數顯恒溫水浴鍋（常州市億能實驗儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱（4.6 mm×250 mm，10 μm）；流動相，80 g/100 g乙腈（A）-20 g/100 g水（B）；流速1.0 mL/min；進樣體積20 μL；柱溫40 ℃。蒸發光散射檢測器條件：飄移管溫度80~90 ℃；氮氣壓力350 kPa；撞擊器為關。

1.2.2 單因素試驗設計

1.2.2.1 溫度對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩定性的影響

取7份樣品，水浴溫度分別為40，50，60，70，80，90和100 ℃，水浴30 min待蜂蜜晶體溶解。稱取樣品，用蒸餾水溶解稀釋至合適的上機濃度過水系濾膜、上機檢測。此條件下pH 7、水浴時間30 min，研究不同溫度對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩定性的影響。

1.2.2.2 水浴時間對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩定性的影響

取5份樣品，水浴時間分別為20，30，40，50和60 min，水浴溫度40 ℃，取樣上機測試試樣中果糖、葡萄糖、蔗糖含量。此條件下溫度40 ℃、pH 7，研究不同水浴時間對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩定性的影響。

1.2.2.3 pH對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩定性的影響

分別用1 mol/L鹽酸和1 mol/L NaOH溶液調節pH，分別制成pH 2，5，7，9和12的溶液。取5份樣品，分別用pH 2，5，7，9和12的溶液溶解別稀釋釋至合適的濃度過水系濾膜上機測定試樣中果糖、葡萄糖、蔗糖含量。此條件下溫度40 ℃、水浴時間30 min，研究不同pH對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩定性的影響。

1.2.3 響應面優化設計

采用Box-Behnken模型，對影響蜂蜜果糖和葡萄糖、蔗糖含量的3個因素（溫度、水浴時間、pH）進行優化設計，響應面試驗因素水平詳見表1。

表1 響應面試驗因素水平表

1.2.4 儲存時間對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩定性的影響

取11份樣品，設定溫度60 ℃，水浴30 min后用水溶解稀釋至適合上機的濃度，室溫放置0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8和9 d，取樣上機測試試樣中果糖、葡萄糖、蔗糖含量。此條件下室溫溫度25 ℃、pH 7，研究儲存時間對蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖穩定性的影響。

1.3 統計方法

每組試驗均重復3次，結果取平均值。響應面設計及優化分析利用Design-Expert 8.0.6軟件，顯著性分析利用Excel 2003軟件。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制及試驗檢測

分別準確稱取5.000 0 g果糖、葡萄糖、蔗糖，溶于水，移入5 mL容量瓶中，加一級水至刻度，混勻，此時溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖質量濃度1 000.0 mg/mL，用一級水繼續稀釋成質量濃度為500.0，200.0，100.0和50.0 mg/mL的標準使用液。過水系濾膜上機繪制標準曲線。標準圖譜見圖1，3種化合物的回歸方程、線性范圍及檢出限標準曲線見表2。結果顯示，試樣樣品中果糖質量分數為35.5 g/100 g，葡萄糖質量分數為30.4 g/100 g，蔗糖質量分數為1.88 g/100 g。

圖1 果糖、葡萄糖、蔗糖標準品液相圖譜

表2 果糖、葡萄糖、蔗糖回歸方程、相關系數及檢出限

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 溫度對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩定性的影響

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖質量分數在40，50，60，70，80，90和100 ℃，水浴時間30 min，pH 7條件下處理結果見圖2。

由圖2可知：溫度對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質量分數穩定性有影響；果糖和葡萄糖、蔗糖這3種糖在溫度60 ℃以上檢出含量開始減少，溫度越高，果糖和葡萄糖質量分數檢出越少，因此，水浴蜂蜜中結晶時溫度宜在60 ℃以下，考慮到水浴鍋升高至60 ℃耗時耗能，故設置溫度40 ℃。

圖2 溫度對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質量分數的影響

2.2.2 水浴時間對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩定性的影響

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖質量分數在水浴時間20，30，40，50和60 min，溫度40 ℃，pH 7條件下處理結果見圖3。

由圖3可知：水浴時間對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質量分數穩定性有影響；果糖和葡萄糖、蔗糖質量分數隨著水浴時間的延長有減少趨勢，因此選定水浴時間30 min。

圖3 水浴時間對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質量分數的影響

2.2.3 pH對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩定性的影響

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖質量分數在pH 2，5，7，9和12環境中處理結果見圖4。

由圖4可知：pH對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質量分數穩定性有影響；在酸性和堿性環境下均為減少趨勢，pH 7環境下蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質量分數檢出最高，因此選定pH 7。

圖4 pH對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩定性的影響

2.3 蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質量分數響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計與結果

綜合單因素試驗結果：溫度、水浴時間和pH對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖含量穩定性有影響，選取溫度、pH、水浴時間3個因素進行響應面試驗設計。采用Box-Behnken模型優化設計提取工藝條件，響應面試驗設計方案及結果見表3，果糖和葡萄糖質量分數回歸方程方差分析見表4，蔗糖質量分數回歸方程方差分析見表5。

表3 Box-Behnken設計方案及試驗結果

由表4可見：模型極顯著（p＜0.01），說明該模型可以預測蜂蜜中果糖和葡萄糖質量分數最優穩定性條件。A、B、A2、B2、C2對果糖和葡萄糖質量分數影響顯著（p＜0.05），C、AB、AC、BC 對果糖和葡萄糖質量分數的影響不顯著；3個條件對果糖和葡萄糖質量分數穩定（C）C pH。

表4 果糖和葡萄糖質量分數的回歸方程方差分析

由表5可見：模型極顯著（p＜0.01），說明該模型可以預測蜂蜜中蔗糖質量分數最優穩定性條件；A、B、C、BC、A2、B2、C2對蔗糖質量分數影響顯著（p＜0.05），AB、AC對蔗糖質量分數的影響不顯著；3個條件對蔗糖質量分數穩定性影響大小順序為（A）溫度＞（B）水浴時間＞（C）pH。

2.3.2 各因素間的交互作用對果糖和葡萄糖、蔗糖質量分數的影響

等高線變化越密集，說明該因素對響應值影響越大。響應面曲線越陡，說明兩者相互作用對響應值影響越顯著，響應曲面越平滑，說明兩者交互作用對響應值影響越不顯著。根據圖5~7等高線疏密程度可知，3種因素對果糖和葡萄糖影響大小順序為（A）溫度＞（B）水浴時間＞（C）pH，根據圖8~圖10，3種因素對蔗糖含量穩定性影響大小順序為（A）溫度＞（B）水浴時間＞（C）pH。再次驗證了表4和表5的分析結果。

圖10 水浴時間和pH交互作用對蔗糖質量分數影響的響應面和等高線圖

表5 蔗糖質量分數的回歸方程方差分析

圖5 溫度和水浴時間交互作用對果糖和葡萄糖質量分數影響的響應面和等高線圖

圖6 溫度和pH交互作用對果糖和葡萄糖質量分數影響的響應面和等高線圖

圖7 水浴時間和pH交互作用對果糖和葡萄糖質量分數影響的響應面和等高線圖

圖8 溫度和水浴時間交互作用對蔗糖質量分數影響的響應面和等高線圖

圖9 溫度和pH交互作用對蔗糖質量分數影響的響應面和等高線圖

2.3.3 響應面試驗模型的驗證

根據響應面模型得到蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖質量分數穩定性最優條件：溫度69.7 ℃、水浴時間37.4 min、pH 7.05，果糖和葡萄糖質量分數理論值為66.474 1%，蔗糖質量分數理論值為1.850 96%。考慮到操作簡便、實用，確定最優穩定性條件：溫度70 ℃、水浴時間35 min、pH 7.0。在此條件下，進行3次驗證試驗，得出果糖、葡萄糖、蔗糖質量分數與預測值接近。

2.4 儲存時間對蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖穩定性的影響

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖在0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8和9 d儲存時間中質量分數分別見圖11。

由圖11可知，果糖、葡萄糖、蔗糖這3種糖質量分數在6 d之內相對比較穩定，隨著儲存時間延長，檢出含量就越低。有可能是隨著儲存時間增加溶液里細菌等微生物滋生，降解蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖從而影響其穩定性，故在測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖含量時進行樣品處理后只適合短期保存。

圖11 不同儲存時間下蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖質量分數的變化

3 結論與討論

采用高效液相色譜法及蒸發光散射檢測器通過溫度、水浴時間、pH這3個因素試驗表明對其穩定性都有影響。采用Box-Behnken響應面試驗設計法研究蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖質量分數穩定性的結果表明，影響果糖和葡萄糖、蔗糖穩定性因素大小順序為溫度＞水浴時間＞pH。穩定性最優條件：溫度70 ℃以下，水浴時間35 min以內，pH 7.0左右。

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖在處理樣品后儲存時間的穩定性試驗結果表明，這3種糖質量分數隨著儲存時間延長，檢出質量分數降低。試樣處理完畢最適宜6 d之內果糖、葡萄糖、蔗糖質量分數相對比較穩定。

果糖、葡萄糖、蔗糖是蜂蜜品質判斷的重要指標，在試驗過程中發現果糖、葡萄糖、蔗糖在高溫、酸或堿性環境下質量分數會降低，有可能是因為溫度較高破壞由于糖類和羥甲基糠醛的降解，產生一些酸性物質，如乙酰丙酸、甲酸、乳酸等物質導致蜂蜜中糖質量分數發生變化[21]。這樣檢測工作者在試驗過程中遇到結晶的蜂蜜試樣可用水浴待樣品全部溶解后定容，但水溫不宜過高；蜂蜜試樣、糖類標準品盡量避免在酸性或堿性環境中儲存，這就需要試驗過程中避免盛放試樣、標準品的容器殘留酸、堿性試劑以免影響試驗結果；蜂蜜試樣隨著儲存時間越長也在不斷地降低，有可能是隨著儲存時間加溶液里細菌等微生物滋生，降解果糖、葡萄糖、蔗糖。在測定蜂蜜試樣處理樣品后只適合短期保存，試樣處理后可于6 d之內上機分析測試。若遇臨界值附近樣品有因未及時上機導致樣品不合格需要重新配制標準品、樣品復測。至于果糖、葡萄糖、蔗糖質量分數減少的真實原因需要科研工作者從微生物、分子結構或其他角度進行深層次研究，為日常檢測工作提供理論依據。