針刺對腦出血大鼠腦組織神經細胞鐵死亡的影響

李明月，戴曉紅，匡炳霖，于學平，滕偉，于薇薇，馬慧慧，陳秋欣，曹洪濤，溫鑫，鄒偉*

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

雖然自發性腦出血病例在腦卒中占比不超過20%，但其仍然與各種類型腦卒中的高病死率和發病率關系密切[1]。因此早期識別腦出血，積極發現腦出血后神經細胞死亡的病理機制和干預方法對于改善腦出血疾病的現狀至關重要。鐵死亡于2012年首次被提出，是一種鐵依賴性的脂質過氧化的損傷過程，近幾年研究發現鐵死亡是腦出血后神經細胞死亡的重要方式[2]。腦出血后血腫溶解,血紅蛋白釋放大量游離鐵，進而引起大量活性氧生成，并誘發脂質過氧化反應，造成質膜破壞，鐵死亡發生[3]。另外鐵死亡另一重要特征是有典型的線粒體形態改變，即線粒體體積縮小，雙層膜密度增強，線粒體嵴減少或缺失，線體體外膜增厚，甚至破裂[4]。針刺在改善出血大鼠肢體功能缺損方面效果顯著[5],同時針灸在抑制腦出血后大鼠神經細胞死亡方面也起到至關重要的作用[6]。然而針刺能否通過抑制神經細胞鐵死亡改善出血后大鼠的神經功能是本研究的重點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供健康清潔級SD雄性大鼠96只，體質量為(280±10)g。大鼠在溫度(22±2)℃范圍內，相對恒定濕度(50±5)%條件下自由飲水、進食，適應性喂養1周后方可入組。將所有大鼠隨機分為假手術組、模型組、針刺組、抑制劑組(DFX)。每組大鼠再按1 d、3 d、7 d 3個時間點隨機分成3個亞組，每個亞組8只。造模前12 h禁食，6 h禁水。

1.2 主要儀器與試劑

立體定位儀(成都儀器廠，STW-1)；牙鉆(上海齒科機械廠，307-6)；針灸針(華佗牌，0.35 mm×40 mm)；丙二醛(MDA)測定試劑盒(WLA048a，萬類生物，中國)；透射電子顯微鏡(HITACHI H-7650日立，日本)。

1.3 腦出血模型制備

大鼠稱重后，按照60 mg/kg比例腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠。大鼠被成功麻醉后，頭部備皮，在備皮處用碘伏常規消毒，后以俯臥位固定于立體定位儀上。取兩耳尖連線中點切口，鈍性分離皮下骨膜，充分暴露前囟點及冠狀縫，以立體定位儀定位坐標點，以前囟點為中心，向右側3.5 mm，向后側0.2 mm，用1.0 mm直徑牙鉆鉆孔至硬腦膜表面。同時剪斷距尾端3 cm處的鼠尾，取血50 μL后將微量注射器固定于立體定位儀上，并沿鉆孔處垂直緩慢進針至基底節處注血，速度為20 μL/min，留針5 min后緩慢出針。斷尾處消毒包扎，局部噴灑慶大霉素并用牙科水泥密封，眼科針縫合。造模后采用Berderson評分法[7]對各組大鼠進行神經功能評分。評分在1～3分大鼠納入本實驗。

1.4 干預方法

模型組采用自體血注入法制備腦出血大鼠模型，造模后不做任何處理。假手術組接受與模型組相同的各項操作，微量注射器于相同位置進針，注入等量生理鹽水，但不注血。針刺組造模后給予針刺治療，選穴部位參照《實驗動物穴位圖譜》，取大鼠百會穴、患側曲鬢穴，由百會向曲鬢穴透刺，以0.35 mm×40 mm針灸針快速刺入，進針深度15 mm，施以快速捻轉平補平瀉手法，捻轉速度為200 r/min，持續捻轉5 min，后間隔5 min，反復操作共3次。抑制劑組按照100 mg/kg劑量給予肌肉注射去鐵胺每日1次。

1.5 指標檢測

1.5.1 神經功能評估

在造模后的1 d、3 d、7 d時間點應用Ludmila Belayev評分法[8-9]進行神經功能評估。該評分法由姿勢反射和放置試驗兩部分組成。放置試驗又分為視覺、觸覺、本體感覺試驗。其中每項按照神經功能缺損程度評分0～2分，各項分值相加最高12分，此時神經功能缺損程度最重。

1.5.2 透射電鏡觀察線粒體形態

將保存在2.5%戊二醛中的待測樣本取出，經0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗后，用1%鋨酸固定液固定3 h。將固定好的樣本依次經過50%、70%、90%乙醇、90%乙醇和90%丙酮(1∶1)混合液、90%、100%丙酮脫水15～20 min，重復3次。經包埋、固化后的樣本使用超薄切片機進行切片，用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，蒸餾水洗凈晾干后讀片。

1.5.3 神經元特異性核蛋白(NeuN)表達

將保存在固定液中的腦組織樣本取出，常規脫水、透明、透蠟、包埋制成5 μm厚度的切片。取出烤好的切片，依次放入二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，無水乙醇Ⅰ，無水乙醇Ⅱ，95%、85%、75%乙醇中浸泡脫蠟至水；抗原修復、過氧化氫孵育、山羊血清封閉后進行一抗孵育，4 ℃過夜；然后在37 ℃條件下滴加二抗，孵育20 min；滴加辣根過氧化物酶標記工作液，37 ℃環境下孵育30 min；DAB顯色；蘇木素復染細胞核，切片經過反藍后，再依次浸入濃度為75%、85%、95%的乙醇中脫水；封片；鏡檢；于400倍鏡下拍照。取其均值作為該組陽性細胞數。

1.5.4 丙二醛(MDA)含量檢測

根據MDA試劑盒說明進行樣本和試劑滴加，經過吸光度測定后進行MDA含量測定。

1.6 統計學分析

所有數據均應用IBM SPSS26.0統計軟件進行分析。結果組間比較采用One-way ANOVA和Tukey’s檢驗，以P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 針刺對腦出血大鼠神經功能的影響

在各個時間點假手術組大鼠未見明顯神經功能缺損。與假手術組比較，模型組大鼠1 d即表現出明顯神經功能缺損(P<0.05)，3 d神經功能缺損最重(P<0.05)，7 d神經功能缺損有所恢復(P<0.05)。針刺組與抑制劑組大鼠在各時間點神經功能缺損程度較模型組明顯減輕，結果具有統計學意義(P<0.05)。針刺組與抑制劑組大鼠神經功能評分在各時間點比較無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠神經功能Ludmila Belayev評分結果分)

2.2 針刺對腦出血大鼠神經細胞線粒體形態的影響

各時間點假手術組神經元胞體中線粒體形態未見明顯改變。模型組1 d神經元胞體中可見散在線粒體體積變小，線粒體嵴減少，線粒體外膜破裂，神經元內細胞器略減少，神經元胞體內可見類似脂質樣物質。模型組3 d神經元內細胞器明顯減少，可見線粒體膜破裂，神經元將近死亡。模型組7 d神經元胞體中線粒體形態有所緩解，但仍可見線粒體體積縮小，線粒體嵴減少和線粒體破裂。針刺組1 d與抑制劑組1 d神經元線粒體形態改變不明顯，以腫脹為主。針刺組3 d與抑制劑組3 d較模型組3 d線粒體形態改變均減輕，可見散在線粒體形態變小，伴有線粒體雙層膜密度增厚及線粒體嵴減少或線粒體膜破裂,同時可見不同程度腫脹的線粒體。針刺組7 d與抑制劑組7 d線粒體形態基本趨于正常，偶有散在腫脹線粒體，見圖1～3。

注：Scale bars:(i)2 μm；(ii)500 nm；黃色箭頭代表正常線粒體；紅色箭頭代表線粒體形態變小，外膜增厚或破裂；m.線粒體；n.細胞核；c.細胞漿。 圖1 各組大鼠腦組織1 d時線粒體超微結構

注：Scale bars:(i)2 μm；(ii)500 nm；黃色箭頭代表正常線粒體；紅色箭頭代表線粒體形態變小，外膜增厚或破裂；m.線粒體；n.細胞核；c.細胞漿。圖2 各組大鼠腦組織3 d時線粒體超微結構

注：Scale bars:(i)2 μm；(ii)500 nm；黃色箭頭代表正常線粒體；紅色箭頭代表線粒體形態變小，外膜增厚或破裂；m.線粒體；n.細胞核；c.細胞漿。 圖3 各組大鼠腦組織7 d時線粒體超微結構

2.3 針刺對出血腦組織NeuN表達的影響

假手術組NeuN陽性細胞數相對較高，各時間點未見顯著差別(P>0.05)。與假手術組比較，NeuN陽性細胞數在模型組各時間點均顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，NeuN陽性細胞數在針刺組及抑制劑組各時間點均顯著增多(P<0.05)，見圖4,表2。

注：Scale bars:100 μm；藍色箭頭為NeuN陽性細胞表達。圖4 各組大鼠腦組織不同時間點NeuN表達比較

表2 各組大鼠腦組織NeuN相對表達量測定結果

2.4 針刺對出血腦組織MDA含量影響

與假手術組比較，模型組在出血后1 d、3 d、7 d MDA含量均顯著升高(P<0.05)。其中模型組1 d與3 d MDA含量，模型組3 d與模型組7 d MDA含量比較差異顯著(P<0.05)，說明腦出血后MDA含量在3 d達到高峰。針刺組大鼠各時間點MDA含量較同時間點模型組明顯減少，結果具有統計學意義(P<0.05)。針刺組與抑制劑組大鼠MDA含量在各時間點比較，無顯著性差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腦組織MDA測定結果

3 討論

鐵死亡是由鐵依賴性脂質過氧化驅動的一種程序性細胞死亡過程。細胞內的很多代謝途徑，如鐵代謝、脂質代謝、氨基酸代謝以及細胞呼吸等(即線粒體三羧酸循環和電子傳遞鏈)都是可以通過產生脂質活性氧[10]而與鐵死亡發生關聯。文獻表明鐵死亡的發生一定會伴有不同程度的線粒體形態和功能的改變[11]，包括線粒體嵴的減少，線粒體體積的減小甚至線粒體的破裂等[12-13]。在一定程度上鐵死亡的發生也與線粒體形態改變程度，能量供應和新陳代謝的損害嚴重程度有關。GAO等[14]在研究中發現半胱氨酸缺乏會導致線粒體膜電位超極化和脂質過氧化物積累，而抑制線粒體三羧酸循環和電子傳遞鏈可減輕線粒體膜電位過極化，減輕脂質過氧化物積累使細胞免于鐵死亡。目前線粒體功能失調已經被認為是與鐵死亡相關的神經系統疾病的一個重要的生化特征[15]。而在腦出血后血腫溶解釋放大量游離鐵，可以驅動細胞活性氧的產生，線粒體作為氧化磷酸化的主要調節因子，是細胞內活性氧產生的主要來源。而線粒體活性氧(mitochondrial ROS,mitoROS)產生的主要來源是細胞內自由的具有氧化還原性的鐵池。研究表明一旦mitoROS聚積，便可與線粒體膜中的多聚不飽和脂肪酸(PUFA)發生反應，導致脂質過氧化、線粒體DNA(mitochondrial DNA ,mtDNA)損傷，以及電子傳遞鏈復合物mtDNA編碼亞基的缺陷[16]。鐵死亡誘導劑愛拉斯汀(Erastin)已經被證實會使mitoROS積累，線粒體通透性轉換孔開放，線粒體膜電位改變以及線粒體ATP耗竭、線粒體碎裂[17]。

在本實驗中我們發現模型組1 d開始神經元胞體中即可見散在線粒體雙層膜密度增加，線粒體體積變小，線粒體嵴減少。模型組3 d神經元死亡明顯，神經元胞體中可見線粒體嵴消失，線粒體破裂，以及神經元死亡。模型組7 d神經元胞體中線粒體形態有所緩解。而在不同時間點針刺組與抑制劑組較模型組線粒體形態改變均較輕，可見散在線粒體形態變小，線粒體嵴減少，偶有線粒體外膜增厚及破裂,多數以腫脹線粒體為主?？梢娽槾淘谝欢ǔ潭壬蠝p輕了神經細胞鐵死亡相關的線粒體形態損傷。另外在本實驗中我們觀察了神經元特異性核蛋白(NeuN)的表達，發現在腦出血后，NeuN陽性細胞數在各時間點均顯著減少(P<0.05)，3 d減少最顯著(P<0.01)，說明在腦出血后存活神經元減少，3 d時存活的神經元最少。與模型組比較，NeuN陽性細胞數在針刺組及抑制劑組各時間點均顯著增多(P<0.05)，可見針刺與鐵死亡抑制劑均可在一定程度上，減輕神經元鐵死亡發生。同時本實驗還進一步觀察了MDA水平。發現腦出血后各時間點MDA水平均顯著升高(P<0.05)，3 d最高。而針刺組與抑制劑組大鼠各時間點MDA含量較同時間點模型組明顯減少。由此我們推測針刺可能在影響神經細胞鐵死亡脂質過氧化方面起到積極作用。

頭針針刺在改善腦出血后神經功能方面已經得到廣大醫學工作者的認可[18]。其中“百會”透“曲鬢”針刺法在減輕腦出血后繼發性病理損傷過程起到舉足輕重的作用，其中包括抑制神經細胞死亡信號傳導[19]。百會向曲鬢穴透刺，可以激發督脈、手足陽經經氣流注于足少陽膽經。陽主動，一身之陽氣的激發可以有助于神經細胞的激活，神經功能的修復[20]。另外通過針刺對大鼠腦出血后不同時段腦內血腫中心等區域神經細胞放電情況研究發現[21]，針刺能夠縮短出血后神經元誘發放電潛伏期，增加放電頻率，改善細胞狀態，緩解神經細胞的病理損害過程，并且針刺在清除血腫引起的神經細胞抑制性泛化方面也起到積極作用。另外針刺也可以降低家兔腦出血組織脂質過氧化產物LPO含量[22]。在本實驗中，我們使用Ludmila Belayev評分評價各組大鼠的神經功能缺損情況，發現模型組自出血后1 d開始即出現神經功能缺損，在隨后的時間點缺損程度逐漸遞增，直至7 d有所緩解。而經過針刺和抑制劑治療后的大鼠在各時間點神經功能缺損程度較模型組明顯減輕。由此推測針刺可能通過抑制出血后腦組織神經細胞鐵死亡促進神經功能修復。

本研究雖然初步證實了針刺對出血后腦組織神經元鐵死亡的相關線粒體形態、NeuN表達和MDA水平的影響，但由于線粒體在鐵死亡中的具體作用還存在爭議[23]，針刺是否通過改善線粒體形態就能抑制鐵死亡的發生以及發生鐵死亡的神經細胞是如何引起線粒體形態改變的具體機制還有待于進一步研究。另外本研究主要針對線粒體的形態進行了觀察，還有一些線粒體代謝相關的調節因子如線粒體脂代謝調節因子(ASCF2和CS)、谷氨酰胺代謝相關因子即(mitochondrial glutaminase 2，GLS2)[24]、TCA周期相關因子(即FH)等也會增強對鐵死亡的敏感性[14]。后續會深入基因水平進行研究，進一步明確針刺對神經細胞鐵死亡影響的作用機制。