基于酶標儀測定的斯氏油脂酵母發酵產油脂條件優化研究

李 艾，郝玉翠

(唐山學院 環境與化學工程系，河北 唐山 063000)

微生物油脂是指產油微生物在碳源充足而其他營養成分缺乏的條件下，將過量碳源轉化合成為甘油三酯，并儲存于微生物細胞內的一種單細胞油脂[1]。微生物油脂主要由十六碳和十八碳的飽和及不飽和的長鏈脂肪酸組成，其脂肪酸組成與棕櫚油、菜籽油、大豆油等植物油相似，是生物柴油的潛在理想替代原料[2-3]。產油微生物中尤以酵母和霉菌類積累的油脂與常規植物油有更相似的脂肪酸[4]。

蘇丹黑B是一種脂溶性的偶氮染料，當產油微生物菌株加入染液后，蘇丹黑B便離開染液而溶于微生物細胞內的脂質中，此時產油微生物細胞內的油脂著色而呈現出一種藍黑色。所形成的藍黑色物在特定波長下吸收峰值的大小與微生物細胞內油脂含量顯著相關，利用該關系可檢測產油微生物細胞內油脂的質量分數[5]。

顯色物質的傳統測定方法為紫外可見分光光度計法，但該方法操作繁瑣、測定時間長，對樣品均一性、穩定性要求嚴格；而且經過染色處理后的產油微生物其細胞壁結構遭到破壞，穩定性下降，細胞更易下沉，均一性很差，因此，利用紫外可見分光光度計對其進行測定時效性短，產生的誤差較大。而全自動酶標儀使用垂直光路檢測，受細胞下沉聚集影響較小，對樣品的均一性要求較低。

產油微生物產油率的高低與碳源、氮源、溫度、培養基碳氮比、接種量等因素有直接關系。趙人俊等[6]在研究被孢霉M14菌株產油脂的條件時，發現有機氮源有利于細胞增殖，而無機氮源有利于油脂的積累。一些產油微生物在碳源充足而其他營養成分缺乏情況下，特別是在氮源限制下油脂會過量積累，因此，碳氮比是決定油脂含量和生物量的一個關鍵因素。有研究表明，提高培養基的碳氮比，有利于細胞內油脂含量的增加[7-8]。在限氮條件下，生物量及油脂含量均隨著碳氮比的提高而增大，但油脂含量達到最大值時，隨著碳氮比的繼續提高，油脂含量卻會有所下降[9]。接種量的大小影響菌株在發酵過程中生長繁殖的速度，接種量較大可縮短菌株繁殖期，使其快速到達穩定期，盡快合成產物，并減少雜菌的污染。但接種量過大會引起溶氧不足，影響產物合成；過小會導致培養時間延長，降低發酵的生產率。

本文以斯氏油脂酵母為研究菌株，基于被蘇丹黑B染色后其吸光度值與油脂含量的正比關系，利用此吸光度值快速反映油脂含量的方法，優化斯氏油脂酵母發酵過程中的氮源、碳氮比(C/N)和接種量三個發酵條件，探討三個因素在發酵過程中對斯氏油脂酵母生長及油脂積累的影響，以便更好地提高此微生物的油脂產率。

1 材料與方法

1.1 菌株

斯氏油脂酵母(Lipomyces Starkeyi，CICC 1809)，購自中國農業微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要儀器設備

3H16RI高速冷凍臺式離心機；M2全自動酶標儀；DMI8 Leica倒置熒光顯微鏡；SGD-IV全自動還原糖測定儀。

1.3 培養條件

YEPD固體斜面培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，瓊脂20 g/L。

種子培養基：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO37 g/L，MgSO41.5 g/L。

限氮發酵培養基：葡萄糖80 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO45 g/L，KH2PO31 g/L。在此培養基的基礎上，對氮源、碳氮比和接種量三個單因素進行優化，以得到斯氏油脂酵母發酵產油脂的最佳條件。

將保藏的菌株接種至YEPD固體斜面培養基，28 ℃培養3～4 d。取適量活化后的菌體接種于種子培養基，28 ℃培養3～4 d。然后取一定量的種子液按一定的接種量接種于限氮發酵培養基中，28 ℃，120 r/min搖床培養。

1.4 分析方法

1.4.1 蘇丹黑B染液的配制

在100 mL 70%乙醇中加入準確量取的蘇丹黑B 0.6 g，室溫下放置6～7 d，待其充分溶解后過濾，將濾液放入棕色密閉瓶于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.4.2 斯氏油脂酵母蘇丹黑B染色后吸收光譜的測定

取2支試管，加入5 mL發酵液。一支作為實驗管加入蘇丹黑B染液0.3 mL，另一支作為對照管加入無水乙醇0.3 mL。將兩支試管振蕩混勻，沸水浴加熱6 min，待冷卻離心棄去上清液后分別用50%的乙醇洗滌菌泥，再三次離心后棄去上清液，然后用70%乙醇溶液混勻菌泥，取96孔板，每孔加入200 μL菌液，用全自動酶標儀測定其特征吸收峰。

1.4.3 斯氏油脂酵母蘇丹黑B染色后油脂含量標準曲線的繪制

采用酸熱-有機溶劑法測定斯氏油脂酵母細胞內油脂含量[10]。取發酵9 d后的發酵液放入離心管，離心得到濕菌泥，稱重后按每克濕菌泥加入15 mL鹽酸溶液(4 mol/L)的比例加入鹽酸，混勻，然后沸水浴中加熱10 min，-20 ℃速冷30 min。冷卻后往離心管內加入等體積的氯仿和甲醇混合液(氯仿和甲醇體積比為1∶2)，混勻、離心、取氯仿層，重復上述步驟，合并氯仿層。50 ℃烘至恒重，冷卻后計算細胞內總油脂量。然后分別取1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL的上述發酵液，稀釋至6 mL。按上述蘇丹黑B染色方法對各個梯度的酵母細胞進行染色，繪制吸光度OD最大吸收峰與對應油脂質量分數之間的相關性曲線。按照上述酸熱-有機溶劑法測得的酵母總油脂量，換算出各個梯度下酵母所含油脂量。

1.4.4 發酵液殘糖的測定

利用SGD-IV全自動還原糖測定儀直接測量[11]。

2 結果與分析

2.1 斯氏油脂酵母蘇丹黑B染色前后對比圖

用顯微鏡觀察斯氏油脂酵母細胞培養9 d時的染色結果，可清楚地觀察到斯氏油脂酵母細胞內的脂滴呈明顯的藍黑色(圖1)。

圖1 未染色(上)及培養9 d后染色(下)的斯氏油脂酵母細胞

2.2 斯氏油脂酵母蘇丹黑B染色后特征吸收譜圖

繪制斯氏油脂酵母經蘇丹黑B染色后的特征吸收譜圖，如圖2所示。由圖2可知，在600 nm處有較為明顯的吸收峰，因此斯氏油脂酵母細胞內油脂與蘇丹黑B結合的最大吸收峰為600 nm。

圖2 斯氏油脂酵母經蘇丹黑B染色后的吸收譜圖

2.3 斯氏油脂酵母細胞內油脂質量分數標準曲線

按上述方法，建立的斯氏油脂酵母細胞內油脂質量分數標準曲線為y=16.164x-50.572(R2=0.991 6)，如圖3所示。結果表明，油脂質量分數和OD600值存在良好的線性關系，根據蘇丹黑B染色后的斯氏油脂酵母細胞的OD600值可直接得出斯氏油脂酵母細胞內油脂質量分數(油脂含量)。

圖3 斯氏油脂酵母細胞內油脂含量與吸光度值的線性關系

2.4 單因素試驗

2.4.1 氮源對斯氏油脂酵母積累油脂的影響

按照含氮量大致相等的原則(氮元素含量為0.582 g/L)，分別選擇硫酸銨(2.02 g/L)、酵母膏(8.31 g/L)、蛋白胨(4.66 g/L)為氮源，碳氮比為55∶1，按10%接種量，其他成分均相同，28 ℃，120 r/min搖床培養。在發酵過程中，定期取樣，檢測蘇丹黑B染色后的OD600值、菌體密度、發酵液還原糖含量，以實時監測菌株發酵積累油脂的情況，分析不同氮源對其發酵產油脂的影響。測定結果見圖4-6。

圖4 硫酸銨為氮源時發酵產油脂情況

由圖4可知，斯氏油脂酵母以硫酸銨為氮源時，還原糖含量從第7 d開始迅速下降，但菌體幾乎不再生長，油脂含量在發酵9 d時達到最大值。由圖5、圖6可知，斯氏油脂酵母分別以酵母膏和蛋白胨為氮源時，還原糖含量降低趨勢相對平緩，油脂含量增長緩慢，同樣在發酵9 d時分別達到最大值。

圖5 酵母膏為氮源時發酵產油脂情況

圖6 蛋白胨為氮源時發酵產油脂情況

由圖4-6可知，發酵9 d，斯氏油脂酵母以硫酸銨為氮源時，油脂含量和還原糖的利用率最高(此時OD600為1.226，還原糖含量為1.01%；而以酵母膏和蛋白胨為氮源時所對應的指標分別為1.049，1.014；1.97%，2.12%)，適合油脂的積累；而以酵母膏為氮源時，菌體密度最大(3.716，而以硫酸銨和蛋白胨為氮源時所對應的指標分別為3.116，3.708)，適合菌體的生長，但不利于油脂的積累。因此，斯氏油脂酵母發酵產油脂選擇硫酸銨作為氮源。

2.4.2 碳氮比對斯氏油脂酵母積累油脂的影響

將活化的斯氏油脂酵母接種于種子培養基中，28 ℃，120 r/min搖床培養48 h，按10%接種量接種于不同碳氮比(分別為55∶1，66∶1，77∶1)的以硫酸銨(含量分別為0.2%，0.168%，0.144%)為氮源的限氮發酵培養基中。在發酵過程中，每24 h取上述三種發酵液分別測定蘇丹黑B染色后的OD600值、菌體密度和發酵液還原糖含量，以考察不同碳氮比對菌株發酵產油脂的影響。測定結果見圖7-9。

圖7 C/N為55∶1時發酵產油脂情況

由圖7-9可知，C/N分別為55∶1，66∶1的發酵液在發酵初期菌體密度增加迅速，而對于C/N為77∶1的發酵液在發酵初期菌體密度增加緩慢。低C/N有利于斯氏油脂酵母菌體的生長；而C/N過高、氮含量過少則會減緩菌體的生長。由圖7可知，C/N為55∶1時，還原糖含量從第7 d開始下降緩慢，此時菌體密度達到最大值，油脂含量則在第9 d時達到最大值。由圖8、圖9可知C/N為66∶1和77∶1時，還原糖含量均從第8 d開始下降趨勢變緩，此時菌體密度達到最大，油脂含量則都在第9 d時達到最大值。

圖8 C/N為66∶1時發酵產油脂情況

圖9 C/N為77∶1時發酵產油脂情況

由圖7-9可知，發酵9 d，C/N為66∶1時，油脂含量和還原糖的利用率最高(此時OD600為1.194，還原糖含量為1.33%；而C/N為55∶1和77∶1時所對應的指標分別為1.126，1.171；1.78%，1.42%)，適合油脂的積累；C/N為55∶1時，菌體密度最大(3.023，而C/N比為66∶1和77∶1時所對應的指標分別為3.002，2.867)，適合菌體的生長，但不利于油脂的積累；C/N為77∶1時，由于菌體密度過低，導致油脂含量降低。因此，斯氏油脂酵母發酵產油脂選擇最適C/N為66∶1。

2.4.3 接種量對斯氏油脂酵母積累油脂的影響

將活化的斯氏油脂酵母接種于種子培養基中，28 ℃，120 r/min搖床培養48 h，按發酵液體積的5%，10%，15%接種于碳氮比為66∶1的以硫酸銨為氮源的限氮發酵培養基中。在發酵過程中，每24 h取上述不同接種量的發酵液分別測定蘇丹黑B染色后的OD600值、菌體密度和發酵液還原糖含量，以考察不同接種量對菌株發酵產油脂的影響。測定結果見圖10-12。

圖10 接種量為5%時發酵產油脂情況

圖11 接種量為10%時發酵產油脂情況

圖12 接種量為15%時發酵產油脂情況

由圖10-12可知，接種量分別為10%，15%的發酵液在發酵初期菌體密度增加迅速，分別在第8 d和第9 d時達到最大值；而接種量為5%的發酵液在發酵初期菌體密度增加緩慢，在第9 d達到最大值。

由10-12可知，當接種量為5%時，發酵液中還原糖含量最高(為2.87%；而接種量為10%和15%時所對應的指標分別為1.53%，1.52%)，菌體密度及油脂含量很低(菌體密度為2.412，OD600為1.194)，說明發酵液中的菌體細胞數目太少時，營養成分不能被其充分利用，因此導致還原糖含量較高，而菌體密度及油脂含量卻都較低。當接種量為10%時，菌體密度(3.140)與油脂含量最大(OD600為1.274)。當接種量為15%時其菌體密度(3.214)與10%接種量相差不多，但油脂含量(OD600為1.189)比10%要低，可能是發酵液中的溶氧相對不足影響了油脂的合成。因此，選擇10%作為最適接種量。

3 結論

通過建立斯氏油脂酵母發酵產油脂含量和OD最大吸收峰的變化曲線可實時監測菌株發酵積累油脂情況。因此，本實驗通過監測蘇丹黑B染色后的OD600值、菌體密度和發酵液中還原糖含量對斯氏油脂酵母發酵產油脂條件進行優化，得到其最佳發酵產油脂的條件：氮源為硫酸銨，碳氮比為66∶1，接種量為10%。

通過監測斯氏油脂酵母發酵過程，發現發酵初期以酵母膏為氮源有利于菌體繁殖，菌體生物量多，因此綜合考慮，如果要提高油脂產量可在發酵初期添加酵母膏，待菌株數量達到穩定時再添加硫酸銨，以便積累油脂。

在實驗過程中發現，雖然斯氏油脂酵母經蘇丹黑B染色后的吸光度值與油脂含量之間線性關系顯著，但是針對不同批次的菌株建立的標準曲線其線性方程會有一定的差別。因此，在發酵過程中如果需要測定油脂的絕對含量，需要每批菌體都繪制標準曲線。