膠體金免疫層析法檢測隱球菌莢膜抗原的診斷價值及隱球菌病患者的臨床特征分析*

張曉慧，陸燕飛，許雨喬，倪 芳，劉根焰，夏文穎

南京醫科大學第一附屬醫院檢驗學部，江蘇南京 210029

隱球菌病是由隱球菌引起的一種亞急性或慢性深部真菌病。隱球菌屬中對人致病的主要是新生隱球菌和格特隱球菌。格特隱球菌感染好發于免疫功能正常的人群，且具有明顯的地域性，如熱帶、亞熱帶地區，我國則以新生隱球菌感染為主[1]。新生隱球菌為條件致病菌，廣泛存在于土壤、干鴿糞、灰塵、人體體表、口腔和腸道中，可經呼吸道侵入人體，隨血流播散至腦及腦膜，也可侵犯皮膚、骨和其他臟器[2]。

新生隱球菌菌體周圍有一圈肥厚的莢膜，是其主要的致病物質。作為其特有的分泌物，隱球菌莢膜多糖抗原的檢測可為隱球菌感染的診斷提供依據。膠體金免疫層析法(CrAg-LFA)是近年新興的一種輔助診斷隱球菌病的檢測方法，具有簡單、快速、特異度高、靈敏度高等特點[3]。本研究應用CrAg-LFA檢測隱球菌莢膜多糖抗原，探討其在隱球菌病診斷中的應用價值，同時對隱球菌病患者的臨床特征進行了分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2020年6月于南京醫科大學第一附屬醫院行隱球菌莢膜抗原檢測的住院患者1 623例作為研究對象，其中男968例，女655例,送檢血清1 349例，腦脊液(CSF)226例，同時送檢血清和CSF 48例。隱球菌病診斷標準參照《侵襲性真菌病定義共識的修訂和更新(2019年歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協作組第三版指南更新)》[4]《隱球菌病處理臨床實踐指南(2010年美國感染病學會更新)》[5]和《肺隱球菌病診治浙江省專家共識》[1]。確診患者均有病原學證據，包括活組織病理檢查、病灶穿刺標本涂片和培養、CSF墨汁染色、真菌培養及莢膜抗原陽性。結合患者臨床表現及典型的影像學檢查，血清CrAg-LFA檢測陽性可臨床診斷為肺隱球菌病，并可作為開始抗隱球菌治療的依據。

1.2試劑與儀器 隱球菌莢膜多糖抗原檢測試劑盒(膠體金法)購自美國Immuno-Mycologics公司；BACTECTMFX400全自動血液培養儀(美國BD公司)；法國生物梅里埃公司VITEK2-COMPACT全自動微生物分析儀及其配套的YST鑒定卡。操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.3方法

1.3.1資料收集 收集隱球菌病患者一般資料、臨床表現、實驗室檢查指標，一般資料包括性別、年齡、吸煙史、動物接觸史等；臨床表現包括無癥狀、發熱、咳嗽、胸悶/胸痛、頭痛、惡心、嘔吐等；實驗室檢查指標包括白細胞計數(WBC)、C反應蛋白(CRP)、IgE測定水平、(1,3)-β-D葡聚糖檢測(G試驗)、半乳甘露聚糖抗原檢測(GM試驗)以及墨汁染色、培養結果等。

1.3.2隱球菌莢膜抗原檢測(膠體金法) 將1滴標本稀釋液加入小試管內，再加入40 μL標本(血清或CSF)，將試紙條的白端沒入到標本液中，10 min后讀取結果。結果判讀：僅出現1個對照條帶表明檢測結果為陰性，出現2個條帶(檢測條帶和對照條帶)表明檢測結果為陽性，若對照條帶未出現說明檢測無效，需重新檢測。

2 結 果

2.1CrAg-LFA對隱球菌病的檢測結果 結果顯示，CrAg-LFA檢測總陽性數48例，其中39例最終診斷為隱球菌病(肺隱球菌病35例，隱球菌腦膜炎2例，隱球菌敗血癥1例，播散性隱球菌病1例)，剩余9例未行進一步確診檢查，均以“肺部感染”為出院診斷。在1 575例CrAg-LFA陰性患者中有7例確診為隱球菌病(肺隱球菌病6例，髂骨隱球菌感染1例)，剩余1 568例均排除隱球菌感染。CrAg-LFA對隱球菌病診斷的靈敏度為84.8%(39/46)，特異度為99.4%(1 568/1 577)。其中，血清CrAg-LFA在肺隱球菌病診斷中的靈敏度為85.4%(35/41)，特異度為100.0%(1 356/1 356)，陽性預測值為100.0%(35/35)，陰性預測值為99.6%(1 356/1 362)，而CSF CrAg-LFA在隱球菌腦膜炎診斷中的靈敏度(2/2)和特異度(272/272)均為100.0%。見表1。

表1 CrAg-LFA對隱球菌病患者的檢測結果

2.2隱球菌病患者臨床特征分析

2.2.1一般資料 46例隱球菌病患者中65.2%(30/46)存在基礎疾病，有27例肺隱球菌病患者有基礎病史，按比例依次為高血壓病(48.1%)、慢性肝病(29.6%)、糖尿病(25.9%)、自身免疫性疾病(14.8%)、惡性腫瘤(14.8%)。此外，有14例肺隱球菌病患者無基礎疾病。41例肺隱球菌病患者中，33例患者通過經皮肺穿刺活檢病理結果得以確診，8例通過CrAg-LFA檢測、典型影像學特征、臨床表現及治療效果等被臨床診斷為肺隱球菌病。41例肺隱球菌病患者中，男24例，女17例，年齡18～80歲，平均(47.0±12.8)歲。其中有11例患者有吸煙史，2例有明確鴿子接觸史。隱球菌腦膜炎患者共2例，男、女各1例，年齡分別為29歲和63歲，未有明顯的動物接觸史。另有播散性隱球菌病、隱球菌敗血癥、髂骨隱球菌感染各1例，年齡分別為49歲、30歲、47歲，既往均無吸煙史及動物接觸史。

2.2.2臨床表現及實驗室檢查 在41例肺隱球菌病患者中，有23例患者因出現癥狀而就診，常見癥狀依次為咳嗽、胸悶/胸痛及發熱。在18例無癥狀的患者中，有14例在體檢時發現肺部病變，均以“肺部病灶性質待查”為初步診斷收治入院。78%的患者就診時無明顯異常的肺部體征，部分患者可出現干濕啰音、呼吸音減低等。2例隱球菌腦膜炎患者中，其中1例因“發熱伴頭痛”入院，體格檢查巴賓斯基征呈陽性，CSF檢查中WBC、葡萄糖及蛋白升高、氯化物降低。另1例因“狼瘡性腎炎”在住院期間出現頭痛癥狀，CSF檢查中僅出現蛋白升高及氯化物降低，余正常。2例患者的CSF培養、墨汁染色及CrAg-LFA檢測均為陽性。見表2。

表2 主要隱球菌病患者臨床表現及實驗室檢查[n/n(%)]

除以上41例肺隱球病和2例隱球菌腦膜炎外，本研究另觀察到3例隱球菌特殊感染患者。1例播散性隱球菌病患者僅有頭痛癥狀，腦膜刺激征為陰性，CSF培養及墨汁染色均未見到隱球菌，但其血清和CSF CrAg-LFA檢測呈陽性，且肺穿刺組織病理檢查見到隱球菌；1例患者因隱球菌感染發生敗血癥，外周血、CSF及骨髓中均培養出新生隱球菌，且CSF墨汁染色及血清CrAg-LFA檢測均為陽性；1例患者因“右下肢疼痛伴活動受限”入院，血清CrAg-LFA檢測呈陰性，經外科手術后病理活檢結果提示為隱球菌感染。

2.2.3治療 46例隱球菌病患者中，43例接受了抗真菌治療。肺隱球菌病患者中35例使用氟康唑，2例服用伏立康唑，病情均好轉，出院后予以序貫治療；余2例因病情危重采用了聯合治療(氟康唑+兩性霉素B)，1例患者主動放棄治療，另1例患者回當地醫院治療，后隨訪患者死亡。2例隱球菌腦膜炎患者中1例因強烈要求出院未用藥，另1例采用了聯合治療(氟康唑+兩性霉素B脂質體)，癥狀好轉，出院后續用氟康唑。3例隱球菌特殊感染患者均采用聯合治療，播散性隱球菌病患者予以兩性霉素B脂質體聯合氟胞嘧啶治療，出院后繼續口服氟康唑，預后良好；隱球菌敗血癥患者經氟康唑聯合兩性霉素B脂質體治療不久后死亡；髂骨隱球菌感染患者手術后予以兩性霉素B脂質體聯合伏立康唑治療，病情好轉。

3 討 論

既往流行病學統計發現，新生隱球菌最常見的感染部位是中樞神經系統，但近年來肺隱球菌病的發病率呈逐年上升趨勢[6]。肺隱球菌病成為繼肺曲霉菌病之后最常見的肺部真菌病變，占20%左右。由于隱球菌病患者的臨床表現及影像學檢查無特異性，故實驗室病原學檢測和組織學檢查尤為重要。目前臨床開展的實驗室檢測方法主要有墨汁染色、真菌培養、莢膜抗原血清學檢測，如膠乳凝集試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。本研究中肺隱球菌病患者痰涂片及培養均未檢出隱球菌，考慮可能是病灶多分布在外周，送檢標本菌量少及標本采集時間錯過最佳培養時間等原因。有研究將傳統的鏡檢及培養法與抗原檢測進行了比較，結果顯示前者對隱球菌的檢出率極低[7]。近年研究發現CrAg-LFA對隱球菌病檢測的靈敏度和特異度均高于膠乳凝集試驗和ELISA，其對實驗室設備的要求不高，操作簡便、快速，10 min即可出結果，逐漸應用于臨床[8]。

本研究對1 623例行CrAg-LFA檢測的住院患者進行統計，發現共有48例為陽性，其中39例完善檢查后最終診斷為隱球菌病。本研究有7例血清CrAg-LFA檢測出現假陰性(6例肺隱球菌病，1例髂骨隱球菌感染)，考慮原因有肺外隱球菌負荷量較低、隱球菌莢膜缺失或感染處于早期等[9-10]。此外，日本一項研究發現在免疫功能正常的肺隱球菌病患者中，血清CrAg-LFA檢測的陽性率較低[11]，本研究中6例假陰性肺隱球菌病患者中有4例免疫功能正常。因此，對于免疫功能正常的肺隱球菌病患者需結合臨床表現、影像學和病理學檢查綜合診斷，以防漏診。

本研究發現CrAg-LFA檢測CSF標本的靈敏度和特異度均為100.0%。1例播散性隱球菌病患者CSF培養及墨汁染色均未見到隱球菌，但CSF CrAg-LFA檢測為陽性，給予抗真菌治療后患者的病情有明顯好轉，考慮原因為CSF中隱球菌量較少，傳統實驗室檢查方法無法檢出。歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協作組和世界衛生組織已推薦將CSF CrAg-LFA檢測作為隱球菌腦膜炎的首選檢查[12]，且其陽性結果作為隱球菌腦膜炎的確診標準[4]。同時，有研究表明CrAg-LFA滴度的檢測可用于評估預后以及監測療效[7,13]。本研究中有1例隱球菌腦膜炎患者入院時CSF墨汁染色、培養及CrAg-LFA檢測均陽性，進行抗真菌治療后，隨著臨床癥狀好轉，墨汁染色及培養菌量減少直至轉陰，CrAg-LFA滴度持續下降，直至完全治愈轉陰。

G試驗和GM試驗作為臨床真菌感染的重要實驗室檢測指標，其診斷范圍并不包括隱球菌感染。對于懷疑肺部真菌感染的患者，當出現G試驗和GM試驗均陰性時，應高度懷疑是否存在隱球菌的感染，但本研究中有1例患者出現G試驗陽性，考慮可能是因隱球菌莢膜丟失導致細胞壁中少量(1,3)-β-D葡聚糖成分暴露。此外，本研究發現55.6%的肺隱球菌病患者出現了總IgE的升高，國外一項研究發現IgE除了在對抗寄生蟲方面的經典作用外，還具有潛在的防御真菌的作用(如隱球菌)[14]。故IgE水平的升高可作為隱球菌病診斷的輔助檢查。

隱球菌感染可出現在各年齡階段，本研究中肺隱球菌病患者年齡主要集中在40～50歲，且男性較女性多見，提示中年男性是肺隱球菌病的高發人群。隱球菌病起病多隱匿，臨床表現及體征均無特異性。2010年美國感染病學會更新的《隱球菌病處理臨床實踐指南》[5]中指出，隱球菌病的易感人群主要包括：人類免疫缺陷病毒感染者，器官移植患者，接受大劑量激素和/或免疫抑制劑治療的患者，其他有基礎疾病的患者。同時研究發現，對于免疫功能低下的患者，隱球菌更易播散至CSF、血液甚至骨髓中。

關于隱球菌病的治療，《隱球菌感染診治專家共識》[15]中指出肺隱球菌病的治療目標是治愈感染，防止感染播散到中樞神經系統。對于免疫功能正常或癥狀較輕的肺隱球菌病患者可采用氟康唑，而免疫抑制伴彌散性感染或嚴重肺炎的患者治療方案同隱球菌腦膜炎，即聯合應用兩性霉素B和氟康唑。本研究中35例肺隱球菌病患者使用氟康唑，另有6例隱球菌病患者接受了聯合治療。

綜上所述，隱球菌病的發病率不斷升高，免疫功能低下的患者易播散至血液或CSF，因此需要做到早診斷、早治療。CrAg-LFA檢測具有無創、準確率高、快速簡便的特點，在隱球菌病的診斷中具有很高的臨床應用價值。G試驗、GM試驗和IgE水平可輔助診斷隱球菌病。對于累及不同部位和不同免疫狀態的隱球菌病患者，需嚴格按照指南用藥。