免疫細(xì)胞表面粒細(xì)胞集落刺激因子受體的表達(dá)調(diào)控及其生物學(xué)意義①

曹勛紅 常英軍 黃曉軍 趙翔宇 （北京大學(xué)人民醫(yī)院血液研究所，北京100044）

粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimu?lating factor，G-CSF），又稱(chēng)集落刺激因子3（CSF3）是體內(nèi)非常重要的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生，是中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［1］。G-CSF 通過(guò)與相應(yīng)細(xì)胞表面的特異性受體G-CSFR（即CSF3R）結(jié)合，激活一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，發(fā)揮多種生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)粒細(xì)胞的分化、增殖與存活，動(dòng)員骨髓造血干細(xì)胞入外周血并且誘導(dǎo)移植物中T 細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）免疫耐受等［2-3］。目前已知G-CSF體內(nèi)應(yīng)用可通過(guò)直接或者間接的方式影響移植物組分中的免疫細(xì)胞亞群；然而，目前公認(rèn)G-CSFR 在髓系來(lái)源的細(xì)胞表面表達(dá)，淋巴細(xì)胞表面G-CSFR 的表達(dá)調(diào)控及其生物學(xué)意義研究目前尚不明確。因此綜述近年來(lái)G-CSF對(duì)免疫細(xì)胞的功能調(diào)控及G-CSFR 在淋巴細(xì)胞中表達(dá)調(diào)控作用的研究。

1 G-CSF 及其受體CSF3R 的分子結(jié)構(gòu)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

1.1 G-CSF 分子結(jié)構(gòu)及細(xì)胞來(lái)源 G-CSF 是由CSF3 基因編碼而成的由204 個(gè)氨基酸構(gòu)成的相對(duì)分子質(zhì)量為25 kD 的糖蛋白。該蛋白同時(shí)包含信號(hào)序列和由174 個(gè)氨基酸組成的成熟蛋白質(zhì)；G-CSF包含了4 個(gè)圓柱的alpha 螺旋，這些螺旋按不同的方向排列，組成了G-CSF 的蛋白排列形式（如圖1）。在生理情況下，人或者小鼠體內(nèi)幾乎檢測(cè)不到血清G-CSF的水平，然而，一旦發(fā)生感染或者損傷等刺激時(shí)，G-CSF水平大幅上升，同時(shí)腫瘤細(xì)胞或組織也會(huì)分泌G-CSF 影響腫瘤預(yù)后進(jìn)展［4-5］。有研究認(rèn)為體內(nèi)大部分組織均可產(chǎn)生G-CSF，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞等［6-8］；且 G-CSF 的分泌除了受細(xì)胞-體液調(diào)節(jié)外，還和神經(jīng)調(diào)節(jié)有關(guān)［9］。

圖1 G-CSF蛋白的拓?fù)洚悩?gòu)的排列形式Fig.1 Topologically heterogeneous arrangement of G-CSF protein

1.2 G-CSF 受體分子結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞分布 G-CSFR是造血素受體超家族的成員，該受體沒(méi)有內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，但當(dāng)與配體結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化，從而刺激與其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相關(guān)的多種酪氨酸激酶的活性，介導(dǎo)不同的信號(hào)傳導(dǎo)功能。G-CSFR 在細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)可分為胞膜外段、胞膜段和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域段。目前認(rèn)為胞內(nèi)不同的結(jié)構(gòu)域可結(jié)合不同的信號(hào)傳導(dǎo)分子從而分別影響相應(yīng)細(xì)胞的增殖、分化、存活及負(fù)調(diào)控通路（如圖2）。G-CSFR 在人體內(nèi)分布廣泛，主要可分為造血組織和非造血組織：前者在造血干細(xì)胞、粒細(xì)胞及其前體細(xì)胞上均有分布，發(fā)揮促進(jìn)造血干細(xì)胞及中性粒細(xì)胞相關(guān)前體細(xì)胞的增殖、分化和動(dòng)員［10-11］；在非造血組織中GCSFR 主要分布在內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)和胎盤(pán)組織等［12］。

圖2 G-CSFR受體結(jié)構(gòu)示意圖（A）及信號(hào)傳導(dǎo)通路（B）Fig.2 G-CSFR receptor structure diagram（A）and sig?naling pathway（B）

近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)淋系中G-CSFR 也有高表達(dá)，并且不同類(lèi)型淋巴細(xì)胞表達(dá)各有差異。有文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)T細(xì)胞表面G-CSFR主要是誘導(dǎo)性表達(dá)，而B(niǎo)細(xì)胞表面對(duì)G-CSFR的表達(dá)是基本存在的［13-14］。

1.3 G-CSF 受體基因多樣性與分子結(jié)構(gòu) 與大多數(shù)造血系統(tǒng)的受體一樣，G-CSFR 包含許多同型異構(gòu)體。有研究表明，目前有7種不同的G-CSFR同型異構(gòu)體存在，這些異構(gòu)體均是由轉(zhuǎn)錄本的可變剪接導(dǎo)致（圖3）。異構(gòu)體缺陷導(dǎo)致不可控的信號(hào)傳遞：EHLERS 等［15］在一個(gè)“AML-BFM 98”的Ⅲ期臨床研究中對(duì)除M3的患者使用G-CSF治療的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，G-CSFR isoform Ⅳ表達(dá)水平低（ISO4＜0.04）的患者經(jīng)G-CSF治療后的五年生存率明顯低于表達(dá)水平高的患者。提示Ⅳ型同形異構(gòu)體表達(dá)缺陷的AML 患者在接受G-CSF 治療時(shí)將不利于患者預(yù)后。KATARZYNA 等［16］對(duì) 57 例自體移植的患者進(jìn)行CSF3R（C＞T，rs3917924）的多肽在性分析后發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者中CSF3R T等位基因是患者造血干細(xì)胞的動(dòng)員效率低的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且因此影響中性粒細(xì)胞的恢復(fù)，進(jìn)一步影響移植預(yù)后。

圖3 G-CSFR的同型異構(gòu)體Fig.3 G-CSFR isoform

1.4 G-CSF 受體連接及其胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo) 當(dāng)GCSF與其特異性受體G-CSFR結(jié)合時(shí)，將引起細(xì)胞表面G-CSFR 的結(jié)構(gòu)性改變并活化其下游的一系列信號(hào)通路如JAK/STAT、PI3K/Akt、p21Ras/Raf/MAPK等［17］。G-CSF 受 體胞內(nèi) 結(jié)構(gòu)域主 要分為 BOX1，B0X2，B0X3，不同的結(jié)構(gòu)域結(jié)合不同的受體酪氨酸家族從而介導(dǎo)不同的功能活性。其中Y704、Y729、Y744、Y764 4 個(gè)胞內(nèi)碳端殘基又與G-CSF 信號(hào)鏈的持久性密切相關(guān)，ZHUANG等［18］通過(guò)酪氨酸-苯丙氨酸替換突變體技術(shù)在小鼠32D 和Ba/F3細(xì)胞中證實(shí)了Y729 是維持Stat5 信號(hào)通路的重要位點(diǎn)，且介導(dǎo)了由SOCS1/3 參與的G-CSF 負(fù)反饋信號(hào)通路的活化。HU 等［19］也通過(guò)此技術(shù)在 32D 細(xì)胞中證實(shí)了Y729 是中性粒細(xì)胞發(fā)育分化的重要靶點(diǎn)，Y729 的突變將導(dǎo)致中性粒細(xì)胞向單核細(xì)胞分化發(fā)育，且在G-CSF 刺激下主要由ERK1/2 信號(hào)介導(dǎo)，因此當(dāng)封閉了ERK1/2 相關(guān)信號(hào)通路時(shí)，中性粒細(xì)胞分化發(fā)育將逐漸恢復(fù)。

闡述G-CSFR 活化后激活的相關(guān)下游信號(hào)通路（圖4）。但是截至目前，G-CSFR 參與的下游信號(hào)通路也只局限于簡(jiǎn)單的直線(xiàn)型的通路闡述，對(duì)于這些信號(hào)通路間是否存在相互關(guān)聯(lián)及它們是如何在細(xì)胞內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)或者互補(bǔ)目前尚未明確。以上的信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)將影響細(xì)胞的存活增殖和分化狀態(tài)。

圖4 G-CSFR經(jīng)配體活化后介導(dǎo)的信號(hào)通路Fig.4 G-CSFR signaling pathway mediated by ligand activation

1.5 G-CSF 受體表達(dá)調(diào)控 G-CSF 與 G-CSFR 接受引起的級(jí)聯(lián)信號(hào)通路介導(dǎo)了多種生物學(xué)功能，然而信號(hào)的持續(xù)活化將不利于機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持，因此明晰G-CSFR 如何在細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控過(guò)程也尤為重要。TAMILA 等［20］的研究證實(shí)了蛋白酶體途徑參與了胞內(nèi)G-CSFR 的降解，從而減弱G-CSF 刺激時(shí)GCSFR 的持續(xù)激活。除此之外，溶酶體途徑也參與了G-CSFR 的蛋白降解調(diào)控［21-22］。但是無(wú)論是蛋白酶體還是溶酶體途徑介導(dǎo)的G-CSFR 調(diào)控，都是基于G-CSF配體與之受體結(jié)合后會(huì)引起的受體內(nèi)吞再循環(huán)。PIPER 等［23］在體外用中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）處理純化人外周血來(lái)源的中性粒細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)與Western blot 檢測(cè)其表面G-CSFR 表達(dá)明顯下降且會(huì)干擾PMN 體外形成集落的能力，進(jìn)一步完善了G-CSFR 的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。然而，目前研究均聚焦于G-CSFR 的降解調(diào)控中，對(duì)于G-CSFR 在細(xì)胞表面誘導(dǎo)表達(dá)增多的調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚無(wú)報(bào)道，G-CSFR 轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)增多可以促進(jìn)G-CSFR 蛋白的翻譯增多，同時(shí)也應(yīng)考慮，細(xì)胞內(nèi)部的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的改變也可能影響G-CSF在細(xì)胞中的分布［24-25］。

2 G-CSF對(duì)免疫細(xì)胞調(diào)控的研究進(jìn)展

2.1 G-CSF 對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)控 中性粒細(xì)胞是外周血循環(huán)中最豐富的白細(xì)胞并且在各種炎癥條件下起致病作用［26］。G-CSF能促使造血前體細(xì)胞分化為完全成熟的中性粒細(xì)胞及可促進(jìn)成熟的中性粒細(xì)胞自骨髓釋放到組織和外周血中，是中性粒細(xì)胞分化發(fā)育及功能活化的重要細(xì)胞因子［27］。中性粒細(xì)胞表面高表達(dá)G-CSF 受體，G-CSF 與其高度特異性受體結(jié)合發(fā)揮重要作用。G-CSF 與G-CSFR 的結(jié)合將誘導(dǎo)不同的信號(hào)通路調(diào)控：Jak-Stat、Ras-MAPK 及 Src 激酶等途徑。WARD 等［28］在研究先天性粒細(xì)胞減少癥的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)活化的STAT5 可以明顯增強(qiáng)G-CSFR 介導(dǎo)的增殖反應(yīng)，小鼠實(shí)驗(yàn)也表明當(dāng)骨髓中缺失STAT5a 及STAT5b 蛋白時(shí)，小鼠骨髓無(wú)法合成中性粒細(xì)胞，提示G-CSFR 在粒細(xì)胞增殖及分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用［29］。除此之外，MAPK 也被證實(shí)在G-CSF 誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞增殖、分化及功能成熟中發(fā)揮重要作用［30］。鑒于此，G-CSFG-CSFR 信號(hào)軸在中性粒細(xì)胞的生物學(xué)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

2.2 G-CSF對(duì)T細(xì)胞調(diào)控 T細(xì)胞是介導(dǎo)造血干細(xì)胞移植后急性移植物抗宿主病（acute graft versus disease，aGVHD）的最主要的免疫細(xì)胞。G-CSF動(dòng)員骨髓造血干細(xì)胞入外周的同時(shí)可增加外周血中10 倍的 T 細(xì)胞，盡管如此，移植后 aGVHD 發(fā)生率卻未顯著增加。這與G-CSF能夠通過(guò)直接和間接的方式誘導(dǎo)T細(xì)胞的免疫耐受有關(guān)。

2.2.1 G-CSF對(duì)T細(xì)胞的直接調(diào)控 早在2003年，F(xiàn)RANZKE 等［31］就發(fā)現(xiàn)體內(nèi) G-CSF 應(yīng)用可誘導(dǎo) T 細(xì)胞表面G-CSFR mRNA 和蛋白的表達(dá)，且伴隨著供者T 細(xì)胞由Th1 型向Th2 型的極化改變。2014 年MACDONALD 等［32］在構(gòu)建的小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸脖砻髁薌-CSF 是直接通過(guò)G-CSFR 作用T 細(xì)胞從而降低小鼠移植后aGVHD 的發(fā)生，雖然AMD3100動(dòng)員劑（主要是CXCR4軸）也可以動(dòng)員CD34陽(yáng)性細(xì)胞，但與G-CSF處理的小鼠相比，只有G-CSF動(dòng)員的小鼠才對(duì)GVHD有保護(hù)作用，提示T細(xì)胞受GCSF調(diào)控的作用與CXCR4 軸誘導(dǎo)的動(dòng)員過(guò)程并沒(méi)有直接影響。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)G-CSF 不能直接上調(diào)T 細(xì)胞表面的G-CSFR表達(dá)，但是當(dāng)T細(xì)胞經(jīng)過(guò)強(qiáng)刺激預(yù)活化后，其表面的CD114表達(dá)明顯增加，此時(shí)G-CSF有協(xié)同增強(qiáng)G-CSFR 表達(dá)的趨勢(shì)。該研究結(jié)果表明GCSF 體外直接刺激純化的活化的T 細(xì)胞，將降低CD4+效應(yīng)細(xì)胞表面CD25 的表達(dá)，且低劑量G-CSF（0.01 ng/ml）即能明顯降低T 細(xì)胞分泌IFN-γ 能力，高劑量（1~10 ng/ml）G-CSF 刺激增加 IL-4 的分泌且有增強(qiáng)IL-10 分泌的趨勢(shì)［33］。造血干細(xì)胞移植過(guò)程中，由于放化療等影響，機(jī)體處于高炎癥因子風(fēng)暴狀態(tài)，活化型因子及各種抗原的釋放是否通過(guò)誘導(dǎo)T 細(xì)胞表面 G-CSFR 的表達(dá)，促使 G-CSF 對(duì) T 細(xì)胞的直接調(diào)控，進(jìn)一步影響受者體內(nèi)T 細(xì)胞的表型和功能狀態(tài)，從而影響預(yù)后，需要進(jìn)一步研究。

2.2.2 G-CSF 對(duì)T 細(xì)胞的間接調(diào)控 盡管G-CSF能夠通過(guò)直接與T 細(xì)胞誘導(dǎo)上調(diào)的G-CSFR 結(jié)合而發(fā)揮免疫調(diào)控作用，目前也已有越來(lái)越多的證據(jù)表明G-CSF 主要通過(guò)影響其他細(xì)胞從而間接調(diào)控T 細(xì)胞的功能狀態(tài)。YANG 等［34］綜述了 G-CSF 通過(guò)影響Tregs、DCs、單核和MDSCs的功能狀態(tài)間接誘導(dǎo)T細(xì)胞的免疫耐受。見(jiàn)圖5。除上所述，G-CSF也能通過(guò)調(diào)控中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)T 細(xì)胞的免疫耐受。MARINI等［35］首次將G-CSF動(dòng)員后的外周中性粒細(xì)胞根據(jù)其表面CD10 分子的表達(dá)有無(wú)分為成熟的CD10+中性粒細(xì)胞亞群和不成熟的CD10?中性粒細(xì)胞，進(jìn)一步分析兩亞群的功能后發(fā)現(xiàn)，雖然G-CSF 動(dòng)員并沒(méi)有增加供者體內(nèi)上述兩亞群細(xì)胞的數(shù)量，但是G-CSF動(dòng)員后的供者相比于未被G-CSF動(dòng)員的供者體內(nèi)的CD10+LDNs 和CD10+NDNs 細(xì)胞比例明顯升高，且體外能夠抑制活化T 細(xì)胞增殖和分泌IFN-γ。這對(duì)如何控制T 細(xì)胞的活化提供了新的思路。2016 年P(guān)EROBELLI 等［36］的小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明了 G-CSF體內(nèi)可以直接誘導(dǎo)能分泌IL-10 的調(diào)節(jié)性中性粒細(xì)胞，且該群細(xì)胞在保留GVL 效應(yīng)的同時(shí)能夠明顯降低移植后aGVHD的發(fā)生。

圖5 G-CSF通過(guò)影響Treg、DCs和MDSC間接改變T細(xì)胞的功能狀態(tài)Fig.5 G-CSF indirectly changes functional status of T cells by affecting Tregs，DCs and MDSC

因此，T 細(xì)胞作為誘導(dǎo)GVHD 和發(fā)揮抗GVL 效應(yīng)的核心要素，進(jìn)一步闡明G-CSF 如何直接或者間接影響T細(xì)胞的免疫耐受的分子機(jī)制將有利于未來(lái)臨床藥物靶點(diǎn)的研究。

2.3 G-CSF 對(duì)DC 細(xì)胞的調(diào)控 樹(shù)突狀細(xì)胞（den?dritic cells，DCs）是一群異質(zhì)性很強(qiáng)的細(xì)胞群體，并且根據(jù)表面標(biāo)志物CD11C 和CD123 的分布情況可歸類(lèi)為髓系來(lái)源的DCs，CD11C+CD123dim，也即髓樣DCs（myeloid dendritic cells，mDCs）和淋系來(lái)源的DCs，CD11C?CD123+，也即漿細(xì)胞樣DC（plasmacytoid dendritic cells，pDC）［37］。G-CSF 動(dòng)員能夠增加健康供者外周血中DCs的絕對(duì)數(shù)量，并且動(dòng)員后CD11c?/CD11c+的絕對(duì)數(shù)比值增加，說(shuō)明G-CSF 以擴(kuò)增漿細(xì)胞樣 DCs 為主［38］。外周血中純化的 mDC 主要誘導(dǎo)Th1 應(yīng)答免疫，而 pDC 誘導(dǎo) Th2 免疫反應(yīng)［39］。有研究發(fā)現(xiàn)G-CSF 動(dòng)員導(dǎo)致健康供者外周血中DC 細(xì)胞表面的CD62L 表達(dá)下調(diào)，而趨化因子受體CCR7 表達(dá)上調(diào)，由此推測(cè)G-CSF 可能通過(guò)改變DCs 表面黏附分子和趨化因子的表達(dá)分布實(shí)現(xiàn)DCs 的動(dòng)員［40］。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，健康供者應(yīng)用G-CSF 后血清中顯著增加的IL-10 和TNF-α 可以促使單核細(xì)胞分化為具有調(diào)節(jié)功能的DCs，后者與初始T 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可誘導(dǎo)分泌TGF-β和IL-10的Tregs產(chǎn)生，從而抑制同種異體反應(yīng)性T 細(xì)胞的活化［41］。盡管G-CSF對(duì)DCs 的調(diào)控目前已經(jīng)得到廣泛的研究，然而以往文獻(xiàn)都是基于體內(nèi)G-CSF 應(yīng)用過(guò)程中進(jìn)一步研究DCs生物學(xué)功能的變化，相關(guān)的基礎(chǔ)研究甚是缺乏。BHARADWAJ 等［42］體外 G-CSF（20 ng/ml）刺激人單核細(xì)胞來(lái)源的DCs后Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pstat3明顯升高，提示G-CSF 可能通過(guò)JAK/STAT 信號(hào)通路介導(dǎo)DCs的分化發(fā)育。JAK/STAT是G-CSF/G-CSFR介導(dǎo)的直接下游通路，因此提示G-CSF 可能通過(guò)直接信號(hào)通路參與了DCs生物學(xué)功能的改變。與此同時(shí)，MORRIS 等［43］2008 年首次闡述了全身放射治療（total body irritation，TBI）后的小鼠體內(nèi)的抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC）將高表達(dá) GCSFR，而同時(shí)使用G-CSF 合并治療時(shí)，將誘發(fā)炎癥APCs的反應(yīng)，從而誘導(dǎo)急慢性GVHD 的發(fā)生。提示DC 細(xì)胞上G-CSFR 表達(dá)可能參與促炎作用。在SIVAKUMAR 等［44］構(gòu)建的小鼠 cGVHD 模型中得以進(jìn)一步證實(shí)，即B6.Sle2c2小鼠由于其DCs細(xì)胞低的表達(dá)G-CSFR，促進(jìn)了調(diào)節(jié)性CD8a+DCs 的存留并進(jìn)一步促使T 細(xì)胞向具有Foxp3 的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分化發(fā)育，誘導(dǎo)免疫耐受。以上均說(shuō)明G-CSF 可能通過(guò)G-CSFR 直接參與了DCs 功能的調(diào)節(jié)，但是具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要更多的研究。

2.4 G-CSF 對(duì)單核細(xì)胞的調(diào)控 G-CSF 動(dòng)員能夠顯著增加健康供者外周血移植物組分中的CD14+的單核細(xì)胞的數(shù)量，且該類(lèi)細(xì)胞以分泌IL-10 這類(lèi)調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子為主，與此同時(shí)，G-CSF動(dòng)員能夠顯著抑制單核細(xì)胞分泌 IL-12、TNF-α、IFN-γ 等炎癥細(xì)胞因子［45-47］。最近，MAVD 等［48］發(fā)現(xiàn)人和小鼠接受 GCSF 后，其外周造血干細(xì)胞中的CD14+單核細(xì)胞不僅能夠以劑量依賴(lài)性的方式抑制T 細(xì)胞的增殖，還可在活化T 細(xì)胞分泌的IFN-γ 的刺激下，產(chǎn)生NO，從而誘導(dǎo)同種異體T 細(xì)胞凋亡，凋亡的T 細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬后釋放的TGF-β 能夠促進(jìn)Treg 細(xì)胞擴(kuò)增，進(jìn)一步誘導(dǎo)T 細(xì)胞免疫耐受。單核細(xì)胞上有GCSFR表達(dá)，但G-CSF是直接還是間接作用于單核細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，目前尚缺乏研究。

2.5 G-CSF對(duì)NK細(xì)胞的調(diào)控

2.5.1 G-CSF與NK細(xì)胞增殖分化的關(guān)系 MILLER等［49］體 外 實(shí) 驗(yàn) 表 明 G-CSF 可 抑 制 外 周 CD34+Lin?DR?前體細(xì)胞分化為 NK 細(xì)胞，而外源性 G-CSF對(duì)成熟NK 細(xì)胞增殖并無(wú)影響性，也不排除NK 細(xì)胞在體內(nèi)經(jīng)G-CSF處理之后細(xì)胞毒性及增殖能力下降是與G-CSF 對(duì)NK 細(xì)胞的間接作用有關(guān)，但是具體調(diào)控機(jī)制仍需要不斷研究。本課題組應(yīng)用CFSE 體外標(biāo)記G-CSF 體內(nèi)運(yùn)用前后的骨髓NK 細(xì)胞，比較NK 細(xì)胞體外7 d 增殖的差異，發(fā)現(xiàn)NK 細(xì)胞的增殖并無(wú)明顯差別，但并沒(méi)有探討G-CSF 體內(nèi)應(yīng)用前后NK 細(xì)胞前體細(xì)胞向NK 細(xì)胞分化發(fā)育能力是否不同［50］。

2.5.2 G-CSF 對(duì)NK 細(xì)胞殺傷活性的影響 SCH?LAHSA 等［51］研究發(fā)現(xiàn) G-CSF 能下調(diào)包括 NKp44、NKp46、NKG2D在內(nèi)的表面活化型受體和減少I(mǎi)FN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-6、IL-8 細(xì)胞因子分泌，從而影響NK 細(xì)胞表型變化并降低其細(xì)胞毒性。但是我中心臨床研究顯示G-CSF 體外并未降低健康供者骨髓NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，然而卻能降低分泌IFN-γ 的NK 細(xì)胞亞群（NK1），與此同時(shí)增加分泌IL-13 的NK細(xì)胞（NK2），分泌 TGF-β 的 NK 細(xì)胞（NK3）和分泌IL-10 的 NK 細(xì)胞（NKr）的比例［50］。從理論上來(lái)講，這可能會(huì)降低移植物的抗白血病效應(yīng)（Graft versus leukemia，GVL 效應(yīng)）。然而有研究發(fā)現(xiàn)G-CSF 雖然削弱了NK 細(xì)胞毒性，但NK1 亞群的減少及NK2、NK3、NKr 亞群比例增多可能對(duì)預(yù)防早期aGVHD 發(fā)病率有效；且當(dāng)G-CSF 逐漸代謝消耗后，NK 細(xì)胞的GVL 效應(yīng)抑制也被解除［52］。基于此，如何發(fā)揮移植物中NK 細(xì)胞的最大GVL 作用仍然有賴(lài)于研究者們對(duì)G-CSF在NK細(xì)胞免疫調(diào)控上的深入研究。

盡管G-CSF 對(duì)NK 細(xì)胞生物學(xué)功能的研究已有不少研究報(bào)道，但缺乏對(duì)于G-CSF 對(duì)NK 細(xì)胞免疫調(diào)控的生物學(xué)機(jī)制研究。2011 年 LAURA 等［51］在監(jiān)測(cè)體內(nèi)NK 細(xì)胞動(dòng)員前后的G-CSFR 表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)NK 細(xì)胞表面高表達(dá)G-CSF 受體，且體外細(xì)胞因子IL-2和IL-15聯(lián)合刺激純化的NK細(xì)胞后，G-CSFR可被誘導(dǎo)性的表達(dá)，但是對(duì)于G-CSFR 在NK 細(xì)胞表達(dá)所代表的生物學(xué)意義尚不清楚，猜想G-CSF 可能通過(guò)其高度特異性受體G-CSFR 參與了NK 細(xì)胞的生物學(xué)功能調(diào)控，對(duì)此還要更多的研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)該假設(shè)。

綜上可知，G-CSF 可以通過(guò)直接或間接的方式調(diào)控多種免疫細(xì)胞，主要誘導(dǎo)免疫耐受從而降低移植后aGVHD 的發(fā)生；另一方面，可通過(guò)多種機(jī)制保留移植物中的免疫細(xì)胞的GVL 效應(yīng)。從而實(shí)現(xiàn)移植后GVHD 和GVL 的分離，是目前臨床上廣泛應(yīng)用的細(xì)胞因子。

3 G-CSFR表達(dá)的病理生理意義

3.1 G-CSF 表達(dá)與炎癥 G-CSF 可以通過(guò)誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞耐受從而達(dá)到炎癥調(diào)節(jié)的作用［53］。然而G-CSFR，作為G-CSF的高度特異性受體在其中發(fā)揮怎樣的作用呢？有研究表明G-CSF 受體阻斷后，將改善甲基化牛血清白蛋白（methylated BSA，mBSA）導(dǎo)致的小鼠關(guān)節(jié)痛和炎癥。中性粒細(xì)胞是炎癥發(fā)生的主要調(diào)控亞群，但是在該模型中，小鼠中性粒細(xì)胞亞群（CD11b+Ly6G+F4/80?）的CS3FR 表達(dá)并無(wú)改變，因此猜測(cè)抗G-CSF 受體降低炎癥反應(yīng)可能是不依靠中性粒細(xì)胞途徑參與的［54］。有研究顯示DCs 細(xì)胞表面G-CSFR 的表達(dá)也會(huì)影響到炎癥進(jìn)展，慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus dis?ease，cGVHD）致病等，可能與免疫反應(yīng)的過(guò)度活化有關(guān)。

3.2 G-CSFR 表達(dá)與腫瘤 有研究表明，人體內(nèi)高G-CSF 水平及G-CSFR 水平是胃癌預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素：一方面是由于G-CSF 可以通過(guò)直接作用刺激胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，另一方面G-CSF 能夠促血管生成［55-56］。由于G-CSF 在機(jī)體炎癥背景下發(fā)揮誘導(dǎo)免疫耐受及可促血管生成的作用，抗G-CSF 的因子刺激可能對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用［57-58］。MORRIS等［59］研究小鼠結(jié)直腸癌的模型表明體內(nèi)拮抗G-CSF因子治療確實(shí)能通過(guò)增加具有免疫效應(yīng)能力的NK細(xì)胞和T細(xì)胞，并且降低腫瘤內(nèi)分泌IL-10負(fù)性調(diào)節(jié)因子的巨噬細(xì)胞的數(shù)量，從而達(dá)到抗腫瘤的作用。同時(shí)，這一模型也進(jìn)一步證明無(wú)論是人還是小鼠結(jié)直腸癌，均伴隨著G-CSFR 和G-CSF 水平的升高，也進(jìn)一步促進(jìn)了G-CSF通過(guò)G-CSF受體在腫瘤背景中傳遞的促癌效應(yīng)。TAKESHIMA 等［60］在 C57BL/6 背景小鼠體內(nèi)構(gòu)建的前列腺腫瘤的模型表明，放療之后能促進(jìn)一群CD11b+Gr?1high+的中性粒細(xì)胞入腫瘤并通過(guò)ROS 毒性殺傷腫瘤細(xì)胞，有趣的是G-CSF的合并使用有利于體內(nèi)清除腫瘤的速度，這間接說(shuō)明G-CSF/G-CSFR 信號(hào)參與了抗腫瘤效應(yīng)。綜上所述，對(duì)于G-CSF 及其下游的G-CSFR 通路在腫瘤背景下是發(fā)揮保護(hù)作用還是促進(jìn)作用目前尚無(wú)定論，我們猜測(cè)，G-CSFR 介導(dǎo)的腫瘤效應(yīng)可能與其活化的細(xì)胞群體有關(guān)，從而介導(dǎo)相關(guān)的信號(hào)調(diào)控。

4 結(jié)語(yǔ)

G-CSFR 在人體組織的分布廣泛，G-CSF 在與其高度特異性受體G-CSFR 結(jié)合后發(fā)揮多種生物學(xué)功能。然而目前其受體多樣性及組織細(xì)胞功能差異性仍缺乏相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道支持，特別是在淋巴免疫細(xì)胞上的可誘導(dǎo)調(diào)控及其介導(dǎo)的相關(guān)生物學(xué)功能仍不清楚。因此明確G-CSFR 的表達(dá)調(diào)控是未來(lái)研究的重點(diǎn)；且G-CSF的生物作用性廣泛，無(wú)論是生理或是病理情況下均發(fā)生重要的調(diào)節(jié)作用，明確GCSF及受體的生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制顯得極為重要。