腫瘤細胞利用Notch信號形成促癌細胞因子微環(huán)境的研究進展①

古心怡 溫俊杰 寧云山③ 李 妍③ （南方醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，廣州510515）

Notch 信號是一種高度保守的信號通路，參與細胞生長、分化等過程，由受體（Notch1-4）和配體（Jagged1-2 和Dll1-3-4）組成。配受體結合后，Notch蛋白被水解成胞內段（intracellular domain，ICN）進入細胞核并作用于由RBP-Jκ、MAML1-3 與其他轉錄相關蛋白組成的轉錄復合體CSL，調控下游靶基因如Hes1 等的轉錄。 Notch 信號通路也參與調控腫瘤細胞與免疫細胞的相互作用，影響細胞因子調節(jié)網絡與免疫系統(tǒng)功能，介導腫瘤的發(fā)生發(fā)展。展示了近年來Notch 信號對細胞因子微環(huán)境和免疫系統(tǒng)的影響（表1）。本文將重點探討Notch 信號通路異常激活形成的腫瘤微環(huán)境（tumor microenviron?ment，TME），以及其中各類細胞因子對腫瘤發(fā)生、發(fā)展、衰老、轉移及免疫反應產生的影響。

表1 Notch信號在細胞因子微環(huán)境與免疫系統(tǒng)中的作用Tab.1 Effects of Notch signaling on cytokine milieu and immune system

1 Notch 信號通路促進腫瘤相關炎癥細胞因子的分泌并形成免疫抑制微環(huán)境

TME 中存在大量的炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β 等，它們構成復雜的細胞因子網絡，調控腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移等，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［28］。而Notch 信號在其中起到重要的調控作用，并參與免疫抑制微環(huán)境的重構。

1.1 TNF-α TNF-α 是 NF-κB 通路的強效激活因子，促進Notch相關腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展［33］。TNF-α激活IκBα 通路，使轉錄因子FOXA2 磷酸化失活，抑制Notch 阻遏蛋白Numb 的表達，從而解除對Notch的阻遏，并激活該通路［34］。TNF-α 還通過激活IκBβ通路，促進 RBP-Jκ 與 Hes1 基因表達，并抑制抗炎因子PPARγ 的作用，同時募集巨噬細胞與中性粒細胞于癌灶局部釋放 TNF-α、IL-6 與IL-1β，引發(fā)炎癥反應，誘發(fā)炎癥相關腫瘤疾病如肝癌等［34-35］。TNF-α還作為反式作用因子激活MDCS 的p65 通路，上調Jagged1/2，介導MDCS 產生癌抗原耐受，削弱CD8+T細胞殺傷作用［36］。此效應在 Lewis 肺癌、結腸癌、胸腺瘤與黑色素瘤的小鼠腫瘤模型都有典型表現(xiàn)。而在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中，Notch與TNF-α 相互作用將導致溶骨。MM 細胞與骨細胞共培養(yǎng)，二者Notch 信號均會激活，骨細胞會發(fā)生凋亡，而MM 細胞活性增強，分泌大量TNF-α，加快骨細胞凋亡進程。僅下調TNF-α 只能延緩骨細胞凋亡進程，而同時阻斷Notch 信號則能完全逆轉其凋亡，延緩MM發(fā)展［37］。

1.2 IL-1β 促炎因子IL-1β主要由巨噬細胞、中性粒細胞和內皮細胞在急性炎癥反應時分泌，引起機體發(fā)熱與全身性炎癥反應。而腫瘤病灶的IL-1β 主要由癌細胞、TAMs 與脂肪細胞產生，其分泌由Toll樣受體啟動，受Notch 信號調控。IL-1β 具有抗癌與促癌的雙重效應，其偏向性取決于不同的腫瘤環(huán)境［15，38］。Notch 與 IL-1β 相互作用能誘導腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）自我更新。如三陰性乳腺癌腦轉移后，癌細胞高水平的IL-1β 會促進鄰近星形膠質細胞高表達Jagged1，激活CSCs 的Notch 信號，促進CSCs 自我更新［39］。在基底樣乳腺癌中，Jagged1 激活的腫瘤細胞釋放ICN1 與ICN3，作用于Notch 基因轉錄起始位點上游 2 085 bp 的 RBP-Jκ 序列，促進IL-1β 分泌，間接提高CCL2 水平，募集腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophage，TAM）及單核細胞于腫瘤病灶，形成免疫浸潤，導致不良預后［15，40］。

1.3 TGF-β TME 中間質細胞與 Jagged1 激活的腫瘤細胞均會產生TGF-β，維持微環(huán)境中IL-1β 與CCL2含量，募集單核細胞，形成免疫浸潤，促進腫瘤產生耐藥性并發(fā)生上皮細胞-間質轉化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）。研究表明，Notch 信號能作用于 Th17、Tregs 與 DCs，從而調控 TGF-β 水平。骨腫瘤細胞的Jagged1/2 與Notch1/2 結合激活Notch信號，使ICN入胞結合Smad3蛋白后共同進入細胞核，在RBP-Jκ 的參與下促進Hes 基因表達RANKL，作用于 DCs 和單核細 胞［41］。腫瘤細胞Notch 信號激活還可使其高表達TGF-βR1，提高TGF-β 敏感性［15］。在尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator，uPA）的作用下，腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）分泌的高水平TGF-β 結合腫瘤細胞TGF-βR1，會促進腫瘤細胞增殖與腫瘤發(fā)展。綜上，Notch信號調控TGF-β水平，將促進骨腫瘤等其他腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展。

1.4 IL-6 腫瘤細胞與腫瘤間質細胞均能分泌高水平IL-6，并與Notch相互作用，重構機體免疫環(huán)境，提高腫瘤耐藥性、侵襲力與增殖力，導致不良預后［11-12，42-44］。上述效應在 MM 與乳腺癌中最為典型。TME中的腫瘤細胞高表達Jagged1/2與Notch3，前者結合間質細胞受體，后者則結合其他腫瘤細胞配體，導致兩種細胞分泌高水平IL-6，激活非經典Notch 信號，維持腫瘤干性。另外，骨髓來源的抑制性 細 胞（monocyte-myeloid-derived suppressor cell，MDSC）會同時分泌IL-6 與NO，二者均會激活腫瘤細胞 Notch 信號：IL-6 促進 STAT3 與 ICN 結合，正向提高IL-6 水平；而NO 則維持STAT3 水平，起到維持腫瘤細胞干性，使其穩(wěn)定傳代的作用［13］。

1.5 IL-4 IL-4 基因3'端下游的保守區(qū)非編碼序列-2 位中存在兩個 Notch/RBP-Jκ 結合位點，提示Notch信號可直接調控IL-4分泌，并與IL-4存在相互作用［45］。Notch 與 IL-4 相互作用可促進 DCs 成熟與分化：Dll4 激活巨噬細胞Notch 信號后，促進其分泌IL-4，為DCs 成熟與分化提供必要條件。若缺乏IL-4，Jagged1激活DCs后反而抑制其成熟，使幼稚細胞大量聚集［10］。Notch 與 IL-4 相互作用還能促進Th2 分化：DCs 的 Jagged2 激活 T 細胞 Notch，在 IL-4存在下可使其分化為Th2，GATA3 在其中起到關鍵作用，IL-2/IL-2Rα 也參與其中［46］。另外，Notch 信號激活能抑制M2 分化，并使成熟的M1 凋亡，這可能與Hes1蛋白結合STAT3后抑制IL-4R通路有關［22］。

1.6 IL-10 IL-10 由TME 中的腫瘤細胞與免疫細胞如Th1 等分泌，其含量高低將決定腫瘤疾病的嚴重程度。Th1 在IL-12 或IL-27 的作用下，或經DCs的Dll配體激活后，會高表達IL-10，起到抑制自身活性的作用［19］。最近研究表明，Notch-IL-10 調節(jié)軸激活能防止肝炎發(fā)生。肝竇內皮細胞Dll 和Jagged 配體會激活Th1 的Notch 信號，提高Th1 靶基因Hes1與Deltex-1 表達水平，進而促進IL-10 分泌而抑制肝細胞炎癥反應［18］。而 Notch 受體缺陷的 CD4+T 細胞則無法分泌IL-10 防止肝炎發(fā)生。Th1 通過Notch-IL-10 調節(jié)軸促進 TAMs 與 M2 向 M1 分化，成熟后的巨噬細胞分泌 TNF-α 與 IL-12，抑制 IL-10 與 TGF-β分泌，發(fā)揮強大的抗癌作用［30］。用 GSI 和 siRNA 阻斷Notch 或敲除巨噬細胞RBP-Jκ，則會使TAMs 分化為M2，分泌IL-10而抑制Th1活性［32］。

1.7 IL-17 IL-17 主要由Th17 細胞產生，也可由CD8+T 細胞、γδT 細胞、NK 細胞與中性粒細胞產生，主要激活NF-κB 通路，誘導各種促炎因子與趨化因子分泌，募集單核細胞與中性粒細胞，引起局部炎癥反應，這與癌癥的發(fā)生密切相關［47-49］。在不同免疫環(huán)境中，Notch 與IL-17 共同發(fā)揮抗癌作用。病原激活 DCs 的 TLR 通路，上調其 Dll4，激活 Th17 的Notch1，使其表達啟動子Ror-γt，反式激活靶基因表達，促進其分泌更多IL-17［50-51］。而CD4+T細胞Notch激活后會分泌 TGF-β 與 IL-6，促進 Th17 分泌 IL-22與IL-23，從而與IL-17 共同發(fā)揮抗癌效應。Jagged1激活DCs 的Notch 信號后促進其高表達IL-2，促進CD25+分泌 IL-17［52］。Notch 還參與 γδT-17 在胸腺與外周免疫器官內的成熟［23］。IL-6使胸腺上皮細胞高表達 Dll4 配體，激活 γδT-17 的 Hes1 基因表達，促進其胸腺成熟［23］；IL-6 還會募集中性粒細胞與單核細胞，促進炎癥反應，發(fā)揮促癌作用［53-55］。另外，腸道與肺內的外周免疫組織細胞也能高表達Dll4 激活γδT-17 的 Notch 信號，促進其外周成熟，并分泌 IL-17和IFN-γ，與TNF-α共同發(fā)揮抗癌作用［7，23，51］。

1.8 CCL5 TME中的CCL5由浸潤性白細胞、間充質干細胞（mesenchymal stem cells）或腫瘤相關成纖維細胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAFs）產生，具有促癌作用。MM 的骨髓間充質干細胞和乳腺癌細胞高表達的CCL5 激活TAM 的Notch 信號后使其分化為M2，引發(fā)EMT；還會促進其產生更高水平CCL5，激活癌細胞AMPK 通路，增強糖酵解代謝，產生大量乳酸［56-57］。Notch 信號與 CCL5 的相互作用會導致幾種結果：第一，募集TAM 并促進癌轉移；第二，高濃度乳酸與低濃度葡萄糖影響T細胞代謝，抑制其增殖與活化并誘導其凋亡，同時使浸潤性T 細胞分化為細胞毒性T細胞；第三，對于不依賴葡萄糖代謝的Tregs細胞，其數(shù)目反而增加［58］。

1.9 CXCL12 CXCL12 也稱為間質細胞衍生因子1（stromal-derived factor 1，SDF1），結合 CXCR4 或CXCR7 受體后介導相關趨化因子分泌。血液系統(tǒng)腫瘤如MM 中，Notch 信號激活后，水解的ICN 可作為反式激活因子上調CXCR4 基因表達水平［25］。而CXCR4 基因缺失的鼠造血祖細胞中，ICN1 促進CX?CR4 表達將導致白血病發(fā)生［59］。Notch 與 CXCL12/CXCR4 能夠協(xié)同構造以Tregs 與M2 等細胞為主的免疫抑制型腫瘤微環(huán)境。二者相互作用會募集前體單核細胞，并促進前體單核細胞分化為M2。因而骨髓瘤患者M2的CXCR4水平遠高于正常人［26］。目前已證實，Notch1 在B 細胞慢性淋巴瘤中能直接促進CXCR4 表達，其他血液系統(tǒng)惡性腫瘤如T-ALL 需同時激活CXCR4 通路與Notch1 才能提高CXCR4 水平［60］。Notch 與 CXCL12/CXCR4 的協(xié)同作用在卵巢癌與肝癌等實體瘤中亦有典型表現(xiàn)，用DAPT與CX?CL12/CXCR4 抑制劑可阻斷此效應［28］。DAPT 阻斷Notch 后會下調 CXCR4 與 CXCL12 水平，使 Tregs 細胞減少，IFN-γ+/IL-10+CD4+與 CD8+細胞增加，打破免疫抑制型腫瘤微環(huán)境，恢復機體適應性免疫力，增強抗癌能力。

2 Notch信號與IFN-γ相互作用調節(jié)免疫細胞功能

IFN-γ 與 Notch 相互作用在 DCs，CD8+T，CD4+T和 NK 細胞中有明顯表現(xiàn)。Notch 與 IFN-γ 相互作用促進DCs成熟，提高其誘導T 細胞生長分化的能力，發(fā)揮重要的抗癌作用［61］。DCs的Jagged1型Notch 激活后，在CD80/CD86 與PI3K 通路的參與下逐步成熟，分泌 IL-12 與 IL-6，其中 IL-6 為激活多種 T 細胞亞型的必要條件［62］。而 Notch 會阻斷 IFN-γ 對 Th2的誘導作用，促進T 細胞向Th1 分化。MAML-/-轉基因小鼠模型證明，Notch 激活的DCs 能誘導CD4+向 Th1 分化，但若缺乏 IFN-γ，即使 Notch 處于激活狀態(tài)，誘導也無法實現(xiàn)［6，63］。這可能由于ICN含量過低，無法充分激活 IFN-γ 基因的 RBP-Jκ 增強子元件［62-63］。因此，T細胞分化為Th1需要IFN-γ與Notch的共同參與。DCs 的 Dll4 或 Jagged1 激活 CD8+T 細胞的Notch2，是CD8+T細胞分裂與活化的前提，也是細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12、穿孔素和顆粒酶B分泌的條件［4-5］。Notch 對 CD8?DC 與 CD8+T 的作用有所不同。在LPS 的誘導下，前者表達MyD88 依賴性Dll4，激活 Notch 信號，促進 Th1 分泌 IFN-γ。小鼠淋巴瘤模型等相關體內外實驗表明，GM-CSF 與CpG DNA 能夠促進 DCs 表達 Jagged2。另外，DCs 還表達Dll配體，與表達Jagged2和Dll配體的巨噬細胞共同激活 NK 細胞的 Notch2，促進 NK 成熟，分泌 IFN-γ，并增強其細胞毒性，并發(fā)揮重要的抗癌作用［18，64］。

3 Notch 信號與IL-1β、CCL2相互作用介導免疫浸潤

Notch 信號在TME 中會促進腫瘤細胞分泌CCL2。在實驗誘導型肝纖維化與慢急性肝衰竭中，此效應由 Dll4 激活［65］；而在其他腫瘤疾病中，則由Jagged1激活［16］。肺癌疾病中，纖維細胞、成骨細胞、內皮細胞和平滑肌細胞均產生高水平CCL2，募集單核-骨髓源性免疫抑制細胞（monocyte-myeloid-de?rived suppressor cells，Mo-MDSCs）與巨噬細胞，促進腫瘤發(fā)展與轉移，而腫瘤抑制因子FBXW7 能降解ICN 與相關癌基因，延緩腫瘤進展，但由于其水平較低，不能充分發(fā)揮作用［3］。腫瘤源性miR-146a 激活骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）Notch1，促進除CCL2 以外的多種細胞因子如IL-8、IL-6、CXCL1、CCL5、IL-10 的分泌，加快腫瘤進展［56］。而黑色素瘤中，沉默Notch 共激動因子MAML1 的黑色素瘤細胞M624 可分泌更高水平CCL2［66］。CCL2會與 Notch 共同促進腫瘤發(fā)展，而肥胖患者有典型表現(xiàn)，這與他們的代謝狀況、激素水平和leptin 含量有關［15］。罹患乳腺癌的肥胖患者體內高水平 leptin 可激活Notch、JAK2/STAT、MAPK1/2K 1/2與PI3K/AKT幾種通路，提高IL-1β水平［67-68］。

4 Notch 信號與VEGF 相互作用誘導血管生成與腫瘤浸潤

TME 中腫瘤細胞與間質細胞分泌的VEGF 會誘導血管新生，為腫瘤細胞生長提供氧分與轉移渠道，而Notch 信號在其中起到重要作用。新生毛細血管由前端細胞與莖細胞組成，它們的比例將直接影響新生毛細血管的出芽與成熟。乳腺癌小鼠移植瘤模型中，關鍵分子leptin 與IL-1 共同促進癌細胞分泌VEGF，激活前端細胞VEGFR2/3 與Nrp1 受體后，前端細胞Dll4激活莖細胞Notch1，上調莖細胞VCAM1，有利于中性粒細胞浸潤和腫瘤細胞的血道轉移［67，69］。前端細胞 Dll4 還會促進自身向莖細胞分化，下調前端細胞/莖細胞比例［70］。莖細胞Notch 激活后，下調VEGFR1/2/3 或促進sVEGFR 分泌，中和VEGF，降低環(huán)境中VEGF水平，減緩血管生成。

多發(fā)性骨髓瘤中，BMSC 的Jagged2-Notch 信號激活會促進MM 細胞分泌VEGF，上調前端細胞Dll4，激活莖細胞Notch 信號，促進莖細胞增殖［71-72］。在神經膠質瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、纖維肉瘤、胰腺癌、大腸癌、肺癌、乳腺腫瘤小鼠病理模型中，若阻遏Notch信號，則誘導血管內皮高表達VEGFR，增加血管分支密度，降低每條分支的血流灌注量造成缺氧，抑制腫瘤生長。結腸癌小鼠腫瘤模型中，VEGF上調CD8+的PD-1，產生免疫抑制，而VEGF-A-VEG?FR 抗血管生成藥可靶向阻斷此效應［73］。在神經系統(tǒng)腫瘤如多形性膠質母細胞瘤中，癌細胞VEGF-C/VEGFR3 通路與Notch 信號相互作用還能介導癌灶淋巴管的形成，為腫瘤淋巴轉移提供條件［74］。因此，阻斷Notch 信號或VEGF 通路能發(fā)揮靶向抗癌效應。

對于結直腸癌與急性T 淋巴細胞白血病，Dll4則激活腫瘤細胞Notch3，打破腫瘤細胞休眠狀態(tài)，使腫瘤細胞重獲增殖力［75］。 目前，人們對Notch 和VEGF 誘導腫瘤血管生成的作用研究較為透徹，但對二者能終止腫瘤休眠的機制卻所知甚少，推測可能與VEGF 和Notch 降低T細胞免疫監(jiān)視功能，打破腫瘤細胞休眠狀態(tài)相關［24］。

5 Notch 信號調控衰老相關細胞因子分泌并介導免疫抑制

Notch 還參與細胞應激反應如DNA 損傷或原癌基因激活，使腫瘤細胞喪失永生化特性與增殖能力而衰老，但仍保留代謝活性與分泌一些細胞因子的能力。衰老的腫瘤細胞仍能募集免疫細胞，發(fā)揮免疫清除功能，有時也會促進毗鄰的非衰老細胞增殖，營造免疫抑制環(huán)境，抑制抗癌作用，加快腫瘤進展。

RBP-Jκ 是 p53 基因的阻遏蛋白，p53 與衰老相關基因p21和促炎因子基因具有相同調控位點。若敲除真皮、口腔粘膜、乳腺和肺組織內原始的腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）的RBP-Jk 基因，會導致腫瘤細胞衰老［76］。Notch1，Notch3 分別與 Jagged1 結合后也能導致腫瘤衰老，其中以Notch1 產生的效應最為典型［77］。衰老途徑有多種，但都要經歷兩個特殊復雜的階段。第一階段稱為Notch 誘導型細胞衰老（notch-induced senescence，NIS），分為癌基因誘導型衰老（oncogene-induced senescence，OIS）與DNA損傷型衰老（DNA damage-induced senescence，DDIS）。高水平TGF-β 能抑制CCAAT/增強子結合蛋白β（CCAAT/enhancer-binding protein β，C/EBPβ）轉錄活性，進而抑制促炎細胞因子分泌，影響淋巴細胞黏附與溢出功能，削弱抗癌能力，形成免疫抑制環(huán)境。若ICN1 水平異常提高會使p16INK4A 高表達，p21 和Rb 去磷酸化，細胞周期將永遠停留于G0/G1期，導致細胞停止生長而衰老［78］。進入第二階段，癌細胞完全衰老，Notch 表達則回到基準水平，C/EBPβ 活性恢復，形成衰老相關分泌表型（senes?cence-associated secretory profile，SASP）［77］。綜上，兩種不同的Notch 水平，對應兩種衰老時相細胞因子的分泌：衰老第一階段，以抗炎細胞因子為主，而第二階段，在Notch1與C/EBPβ的相互作用下，則以促炎細胞因子與基質重構酶（MMP1、3、10）為主［77］。

盡管Notch 與其他通路的相互作用導致細胞衰老的機制仍未全部闡明，但其介導衰老相關TME，影響抗癌免疫的效應卻已明晰，這為Notch 信號靶向抗癌療法奠定基礎。

6 結論與展望

細胞因子調節(jié)網絡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，一些信號通路如Notch 信號的異常激活將導致腫瘤細胞與細胞因子調節(jié)網絡發(fā)生異常的相互作用，產生多種復雜的免疫反應，甚至重構患者的免疫環(huán)境［79］。針對這些信號通路的靶向療法理論上可恢復正常免疫環(huán)境，提高治愈率與患者生存率。目前，阻斷Notch 信號的靶向療法大多依賴GSI 但由于缺乏針對性，容易產生胃腸道毒副作用，導致胃黏膜腸上皮化生，因此該應用受到限制。但如今已有Notch1、Notch2/3 和Dll4 單抗藥物與小分子Jagged1/2靶向藥物問世，這些藥物能特異性抑制Notch 信號，減輕副作用［80-84］。但大多數(shù)腫瘤發(fā)病機制并非單純依賴一條信號通路，如Notch 信號會聯(lián)合NF-κB、CXCR4/CXCL、STAT 等其他相關通路發(fā)揮作用，共同導致腫瘤發(fā)生。因此，攻克腫瘤道阻且長，而機制的闡明為抗癌第一關，鑒于Notch 信號對細胞因子網絡的調控作用，未來可以針對其進行抑制，從而干預其介導的腫瘤增殖、侵襲、轉移和血管生成，為腫瘤治療提供潛在的治療靶點。