甘露糖化殼聚糖納米粒靶向巨噬細胞的應用研究進展①

嚴麗麗 謝 勇 閔衛平③ （南昌大學第一附屬醫院，南昌330006）

巨噬細胞源自單核細胞，存在于各種組織中，與全身的疾病發生發展相關，在體內發揮先天性免疫和細胞免疫作用。由于其表型和功能具有多樣性特點，靶向巨噬細胞并調控其功能已成為治療疾病的重要方法［1-2］。其中通過調節巨噬細胞相關受體，由受體介導的靶向系統治療相關疾病已成為研究熱點［3-4］。殼聚糖（chitosan，CS）作為非病毒載體具有良好的生物相容性和安全性，且負載效率高，可作為優良載體的首選材料［5］。對CS 進行配體修飾，枝接甘露糖，可得到由巨噬細胞表面高表達的甘露糖受體（mannose receptor，MR）介導的主動靶向巨噬細胞的基因和藥物遞送系統。近年來，新型藥物的出現及外來基因編輯對許多復雜性疾病具有巨大的治療潛力，甘露糖化殼聚糖納米載體經靶向遞送將攜帶的基因或藥物遞送至目標部位，能夠達到更加安全高效的治療效果［6］。

1 甘露糖化殼聚糖納米粒的特性

納米材料具有生物相容性好和靶向性特點，可通過與生物大分子（多肽、糖類、葉酸等）間的特異性相互作用提高靶向性能，因此被廣泛應用于生物醫學研究和靶向遞送［7］。其中殼聚糖納米粒作為負載藥物和基因的優良載體，成為近年來生物材料的研究熱點，并在醫藥、生化和生物醫學工程等領域廣泛應用［8］。

CS又稱脫乙酰甲殼素，化學名稱為聚葡萄糖胺（1-4）-2-氨基-B-D 葡萄糖，相其對分子質量從數十萬到數百萬［9］。由于CS 是自然界唯一的聚陽離子堿性多糖，具有低毒性、生物相容性、結構易修飾等特點，可作為良好的生物納米材料。但CS作為載體缺乏細胞特異性和主動靶向性，不能發揮特異性靶向作用。在生物大分子納米材料中，甘露糖基納米材料在靶向治療方面取得了很大進展，并為免疫調節治療提供了有效靶點［10］。MR 屬于多凝集素受體，可通過受體介導的內吞作用維持內環境的穩定，啟動特異性免疫應答，對于有效治療各種疾病至關重要［11-12］。MR 作為該家族的原型，已成為配體靶向的模型受體，通過與優良載體結合，負載基因、藥物和疫苗等方法被廣泛研究［13-14］。因此，對CS 進行配體修飾，得到甘露糖化殼聚糖納米粒（manno?sylated chitosan nanoparticles，MCS-NPs），通過巨噬細胞表面高表達的MR 介導的主動靶向作用，可作為安全高效、特異性靶向的優良載體。

靶部位、目的基因或藥物、轉運載體三者的特異性結合是靶向遞送系統治療疾病的關鍵。由于納米粒子的表面效應和小尺寸效應，對藥物具有可控性釋放作用以及能夠保護基因免受核酸酶的降解，已用于多種疾病尤其是癌癥方面的治療［15-16］。因此，利用納米載體與配體結合制備的MCS-NPs，不僅生物相容性及穩定性良好，毒性低，并且能夠使藥物或基因特異性靶向，增加靶部位的攝取量，從而提高藥物的生物利用度和基因的轉染效率，達到更加安全高效的治療效果。

2 MCS-NPs的制備方法

目前制備殼聚糖納米粒的主要方法有復凝聚法、聚電解質絡合法、離子凝膠法、微乳液法、共價交聯法、溶劑蒸發法、共沉淀法等［17］。CS 及其衍生物經修飾后制備納米粒的方法與殼聚糖納米粒相似，其中復凝聚法和離子凝膠法是制備CS及其衍生物最常用的兩種方法。STIE 等［18］用離子凝膠法制備了180~280 nm 的殼聚糖納米粒，裝載BSA 和p53至人皮膚黑色素瘤細胞。研究表明，利用離子凝膠法制備的納米粒能夠有效促進細胞對蛋白質的攝取，該方法制備的藥物或基因遞送系統在體內外的生物醫學應用中具有重要價值。YAO 等［19］利用復凝聚法制備了甘露糖化殼聚糖（MCS）包裹胃泌素釋放肽（pGRP）質粒，形成了約為210 nm 的MCS-pGRP-NPs，以抗原提呈細胞為靶點，經小鼠鼻腔黏膜給藥，通過納米載體提高疫苗接種效果。實驗結果表明，MCS-NPs 是一種高效的靶向基因傳遞載體，MCS-pGRP-NPs 能夠與巨噬細胞上的C 型凝集素受體結合，通過MR 介導的內吞作用增強細胞攝取，對抗腫瘤免疫治療具有潛在應用前景。納米粒子的大小、穩定性及毒性等都與制備工藝有關，根據實驗需要，選擇合適的制備方法，達到研究目的。

3 殼聚糖納米載體負載基因和藥物的作用機制

CS是天然存在的陽離子聚合物，其結構中的游離氨基使其帶有正電荷，生物黏膜表面的類脂層荷負電，易與CS 中的陽離子發生靜電吸附，增強被負載基因和大分子藥物透過黏膜吸收的能力［20］。殼聚糖納米粒子在酸性溶液中帶正電荷，能夠與帶有負電荷的DNA 通過電荷間的相互吸引迅速渦旋混合形成納米級復合物。因其靜電吸引通過空間位阻效應，使得DNA 免受核酸酶的降解，并且形成的納米級復合物有利于細胞對基因的攝取，延長了藥物在體內的滯留時間，減少胃腸道對藥物的降解，提高藥物的生物利用度，使得納米遞送系統在疾病治療中發揮重要作用［21-22］。

因此通過對CS進行配體修飾得到MCS-NPs，由甘露糖受體介導攜帶藥物和基因特異靶向巨噬細胞的遞送系統，能夠發揮更高效的治療作用［23-24］。

4 MCS-NPs在疾病中的治療作用

4.1 MCS-NPs 藥物遞送系統在疾病中的治療作用 納米載體藥物遞送系統由于其優良的性能，在疾病治療應用方面日益擴大，在治療腫瘤相關疾病方面尤為突出［25］。經配體修飾后的納米載體，不僅能夠促進藥物吸收，改善藥物在體內的分布，還能高效靶向目標部位，從而提高藥物的生物利用度，達到更好的治療效果［26-27］。

圖1 MCS-NPs負載基因或藥物系統靶向巨噬細胞結構圖Fig.1 Structure of MCS-NPs gene/drug delivery system targeting macrophages

ESFANDIARI 等［28］及 AFZAL 等［29］研究 了 口服巴龍霉素（PM）對內臟利什曼病的治療效果。由于PM 的口服吸收率低，半衰期短，藥物效價低，因此，ESFANDIARI 等［28］合成了MCS，包裹PM，與右旋糖苷制備成MCS-dex-PM-NPs。實驗表明該納米傳遞系統對巨噬細胞具有高效靶向性，低細胞毒性，對利什曼原蟲感染具有良好的治療效果。AFZAL等［29］利用甘露糖-硫醇化殼聚糖（MTC）與聚乙酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）包裹PM 制備MTC-PLGA-PMNPs，與游離的 PM 相比，MTC-PLGA-PM-NPs 在利什曼原蟲感染的巨噬細胞模型中，巨噬細胞對其攝取能力和殺蟲能力增強。體內研究顯示MTC-PLGAPM-NPs 治療后杜氏利什曼原蟲感染的BALB/c 小鼠模型中的寄生蟲的數量大大降低。CHAUBEY等［30］合成了 MCS，包裹姜黃素，制備成 Cur-MCNNPs，研究其對利什曼原蟲的療效和毒性評價。體內外實驗結果表明，與殼聚糖納米粒包裹的姜黃素及直接作用的姜黃素相比，Cur-MCN-NPs 對治療利什曼病具有更顯著的效果。

XU等［31］將MCS包裹牛血清白蛋白（BSA），并利用聚丙烯酸樹脂腸溶包衣制備成BSA-MCS-Edu-NPs。研究表明，該納米粒在胃腸液中具有良好的穩定性，被負載的BSA 主要通過M 細胞促進其在PP結中的積累量以及提高對抗原提呈細胞的靶向能力，從而誘導較強的系統性免疫應答，為口服疫苗的接種提供新的思路。黃燕等［32］研究了甘露糖化羧甲基殼聚糖包裹依替膦酸形成納米粒子靶向M2型巨噬細胞治療惡性腫瘤。結果顯示，甘露糖化羧甲基殼聚糖與依替膦酸復合物對M2 型巨噬細胞具有靶向能力，MCS-NPs 靶向巨噬細胞作為治療腫瘤的研究靶點具有重要的臨床意義。

細菌感染仍然是死亡的主要原因之一，細菌耐藥性的出現對人類健康構成了巨大的威脅。COYA等［33］利用甘露糖修飾的三甲基殼聚糖納米粒（MTCNPs）研究巨噬細胞對細菌感染的反應，應用新的納米治療策略提高療效。作者使用結核分枝桿菌作為細菌感染的模型，研究MCS 納米載體對人體巨噬細胞反應的影響機制。研究發現，MTC-NPs 在很大程度上改變了結核分枝桿菌感染巨噬細胞的反應，通過mRNA 測序顯示，由于MTC-NPs 的攝入，近900個基因出現差異表達。進一步結果分析顯示，這組被調控的基因參與細胞代謝，尤其是氧化磷酸化和糖代謝途徑。因此，將具有調節代謝的納米顆粒與藥物相結合，是治療該類疾病的一種有效策略。

殼聚糖及其衍生物本身作為一種藥物輔料具有較理想的安全性能，使得CS和納米粒子作為藥物載體的研究在多領域迅速發展［34］。隨著MCS-NPs載體的優良特性逐漸展現，在治療各種疾病中起到了良好的應用。

4.2 MCS-NPs 基因遞送系統在疾病中的治療作用 基因治療是指將外源基因導入靶細胞，通過基因表達來治療或預防疾病的潛在方法［35］。制備安全有效的基因載體是基因治療的關鍵，MCS 作為可降解、低細胞毒性的非病毒基因載體，在基因治療中發揮重要作用［36］。

ASTHANA 等［37］將 MCS 包 裹 反 義 寡 核 苷 酸（AON）制備成納米粒靶向遞送至巨噬細胞，考察其納米粒復合物的特性，以及AON 體外轉染至巨噬細胞的效率。研究發現，MCS 作為巨噬細胞的靶向載體，具備基因遞送系統的理化性質，MCS-NPs 是一種安全有效的基因載體，對RAW264.7 細胞無明顯細胞毒性，并且具有較高的基因轉染效率。YAO等［19］利用 MCS 裝載 pGRP 質粒制備成納米粒，研究其對巨噬細胞的靶向能力和轉染效率。結果顯示，MCS 能夠保護pGRP 不被核酸酶降解，與CS 相比，MCS 通過MR 介導的內吞作用能夠提高轉染效率。因此，以巨噬細胞MR 為靶點的MCS 納米載體具有潛在的應用價值。

HE 等［38］利用雙靶向納米載體遞送寡核苷酸（ODN）至巨噬細胞克服腫瘤相關免疫抑制。由于甘露糖受體和CD44 受體在巨噬細胞表面高表達，作者制備了雙靶向甘露糖化羧甲基殼聚糖-透明質酸-硫酸魚精蛋白/寡核苷酸納米粒（MCMC/HA/PS/ODN/NPs），與單靶向的 HA/PS/ODN/NPs、MCMC/PS/ODN/NPs 及非靶向的 CMC/PS/ODN/NPs 相比，在靶向性評價、細胞毒性、腫瘤抑制等方面，雙靶向MCMC/HA/PS/ODN/NPs 可實現巨噬細胞的高效靶向，低毒性，并能顯著增強免疫刺激。因此，雙靶向載體負載的CpG-ODN 在腫瘤治療中具有良好的應用前景。DENG 等［39］通過納米載體將 miR-146b遞送到腸道巨噬細胞治療潰瘍性結腸炎。作者通過甘露糖修飾三甲基殼聚糖包裹miR-146b，制備成MTC-miR-146b-NPs，研究了miR-146b 在小鼠結腸炎模型黏膜修復過程中的表達水平、DSS 誘導的結腸炎模型中對小鼠黏膜的再生情況及miR-146b?/?小鼠CAC的抑制作用。結果顯示，MTC-miR-146b-NPs具有高的包封效率和延時作用，可選擇性地靶向腸道巨噬細胞而無細胞毒性，可作為腸道疾病研究的有效載體。MTC-miR-146b-NPs 可作為口服給藥的有效候選藥物，提高潰瘍性結腸炎和結腸炎相關癌癥的免疫治療效果。

基因治療的有效性在很大程度上取決于基因遞送系統的優良特性：靶向性強、細胞毒性低、基因免受核酸酶降解、基因轉染效率高等特點。基于CS及其衍生物，經配體修飾后由受體介導的靶向載體具有很大的治療潛力，近年逐漸成為疾病治療的熱點研究方向。

5 結語

綜上所述，CS 作為非病毒載體，對其進行結構修飾，形成受體介導的靶向遞送系統，已經被廣泛嘗試應用于基因和藥物遞送。MCS-NPs 安全高效，提高了藥物的利用度和基因轉染效率，在疾病治療中發揮重要作用。但配體枝接CS 主動靶向系統也存在一些局限性，例如工藝過程中目的產物產率，納米復合物的穩定性，如何精確控制納米粒徑，對工藝參數的優化和從實驗室到中試工廠再到生產水平的規模化等問題還有待進一步研究。現有的研究大多局限于細胞和動物水平的研究，仍需要進行更多臨床試驗相關的體內外研究。然而，經配體修飾的主動特異性靶向遞送系統已在疾病治療中顯示出了良好的性能，具有潛在的應用前景和臨床價值。