胞質DNA感受器cGAS的研究進展①

譚 星 龐曉燕 郝秀靜 李 敏

（寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川750021）

當機體受到病原體入侵或自身發生損傷時，機體內的天然免疫系統會做出快速響應，首先通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）監測到細胞內外及細胞質基質環境中的病原入侵或細胞損傷等危險信號，然后識別特異病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）或損傷細胞釋放的損傷相關分子模式（danger-asso?ciated molecular patterns，DAMPs），二者的激活會引發信號傳導級聯反應，從而導致細胞自主防御機制的啟動，以及可溶性介質（如Ⅰ型干擾素和促炎性細胞因子）的產生［1-3］。研究已經證明多種PRRs 的存在，如位于細胞膜上的C 類外源凝集素受體（C-type lectin receptors，CLRs）、位于細胞膜及胞內體膜上的Toll 樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）、位于 細 胞 質 中 NOD 樣 受 體（NOD-like receptors，NLRs）、位于細胞質中的視黃醇誘導蛋白受體RIG-Ⅰ樣受體（RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs），還有在細胞質中新發現的環磷酸鳥苷-腺苷合酶（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS），其是第二信使——環磷酸鳥苷酸腺苷酸（cyclic guanosine monophosphate-adenosine mono?phosphate，cGAMP）的合成酶，是一種普遍認可的DNA感受器［4-6］。cGAS可識別外源DNA及機體自身損傷細胞外露的核質或線粒體DNA，誘導先天性免疫激活，產生促炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素，因此cGAS 在真核細胞中的固有免疫發揮重要作用［7］。本文將對cGAS及其功能最新研究進展進行綜述。

1 cGAS概述

2013 年陳志堅團隊通過一系列的質譜分析和蛋白質純化技術發現了一種新的DNA 感受器——cGAS［6］。cGAS 是由 522 個氨基酸組成、分子量約60 kD 的蛋白質，是核苷酸轉移酶家族中的一員，含有1個核苷酸轉移酶結構域和2個主要的DNA 結合結構域，N 端是由大約130~150 個殘基構成的不完全保守、非結構化的延伸片段，中間段為保守的核苷酸轉移酶基序NTase 結構域，C 端為Mab21 結構域［6，8-9］。cGAS C 端結構域中有 1 個高度保守的鋅囊結構，結構中的鋅離子主要起維持蛋白結構作用，該結構是cGAS 識別雙鏈DNA（dsDNA）的重要位點之一，抑制其將導致無法識別dsDNA［10-12］。沒有dsDNA 時，cGAS 處于自我抑制狀態，當與 dsDNA 結合后，誘導cGAS 催化中心構象變化，暴露出酶的活性中心，cGAS 氨基酸殘基R150 和R192 插入到與DNA 結合后的雙螺旋空隙中，穩固cGAS-DNA 復合體［13-15］。對 cGAS-DNA 晶體結構的研究發現，cGAS主要與DNA 的磷酸-核糖骨架結構結合，不與堿基結合［10，15-17］，cGAS的激活不依賴核苷酸序列，這解釋了cGAS 能夠識別幾乎所有類型DNA 的原因，單鏈DNA 只要能夠形成短的堿基配對片段也能激活cGAS，但激活的結構基礎仍有待確定［18］。cGAS 與dsDNA的結合與長度和濃度也有一定關系，當dsDNA長度大于16 bp時，才能有效跨越cGAS二聚體的2個DNA 結合位點激活酶活性，大于45 bp 時，可引起更強的酶活性［17］；在低 DNA 濃度下，由 DNA 刺激產生的Ⅰ型干擾素只與cGAS 和dsDNA 的長度有關，小于20 bp 的dsDNA 只有在cGAS 濃度很高時才能在體外誘導cGAS催化活性［19］。

目前cGAS 的定位仍存在爭議，現可通過蛋白純化、免疫印跡、免疫熒光和質譜分析等技術檢測cGAS，最先陳志堅團隊從THP-1 細胞制備胞質和核提取物，通過免疫印跡在胞質提取物中檢測到cGAS，共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察到cGAS 蛋白分布在細胞質中［6，20］。但 BARNETT 等［21］通過對THP-1細胞cGAS 的亞細胞定位和功能的詳細分析得出結論：cGAS不是胞漿蛋白，而是由cGAS N 端的磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸酯介導的膜蛋白，并發現N-末端結構域均勻地分布在所有被檢測細胞類型的質膜上，認為 N 端是一個定位結構域。GENTILI 等［22］通過分析與 BARNETT 等［21］的研究一致的 cGAS 突變體，發現沒有N-末端結構域的情況下，cGAS 在細胞核內積累，且這種積累與基礎天然免疫激活增加有關，但當單獨表達時，cGAS 的N-末端結構域也定位于細胞核，而不是BARNETT 等［21］報道的質膜，但通過位于殘基161 和212 之間的N-末端區域活躍地保留在細胞質中。與此同時另一項研究證明中，VOLK?MAN 等［23］研究發現在細胞周期的所有階段，在所有被實驗細胞中，絕大多數激活前的內源性cGAS 定位于細胞核，且其位置與細胞周期階段或cGAS 自身激活狀態無關。因此cGAS 的亞細胞定位仍需要深入研究［24］。

2 cGAS-cGAMP-STING通路

cGAS 作為DNA 感受器的作用機制主要依賴于cGAS-cGAMP-STING信號通路［25］。既往研究已經證明，STING 是雙鏈DNA 誘導的天然免疫反應中關鍵的信號傳導蛋白，是一種跨膜蛋白，在巨噬細胞、內皮細胞、樹突狀細胞、T 細胞等中廣泛存在，在DNA感受通路中起重要作用，且STING 在體內與DNA 共定位，但在體外僅以低親和力結合DNA，進一步證明了 cGAS 的存在［6，13，26-27］。cGAS-cGAMP-STING 信號通路的作用方式如下：首先cGAS 與DNA 結合誘導了cGAS 活性位點結構的變化，從而催化ATP 和GTP 合成 cGAMP［6，13，16-17］。cGAS 合成的 cGAMP 含有2 個磷酸二酯鍵，一個位于 GMP 的 2'-OH 與 AMP 的5'-磷酸之間，另一個位于 AMP 的 3'-OH 與 GMP 的5'-磷酸之間，cGAS 催化形成2'-5'鍵，隨后通過環合作用形成3'-5'鍵，這種cGAMP 異構體稱為“2'3'-cGAMP”［10，28-30］；接下來 2'3'-cGAMP作為第二信使是IFN 基因的銜接蛋白刺激物（STING）的內源性高親和力配體［13，28，31-32］，其具有獨特的 2'-5'磷酸二酯鍵，可結合下游信號分子 STING［10，30］，誘導 STING 構象發生變化，形成有活性的STING 二聚體，STING 的二聚化是產生IFN 的關鍵條件。隨后STING 從內質網轉移到高爾基體，在這個過程中STING 的羧基末端結合并激活激酶TBK1，進而促進干擾素調節因子（IFN regulatory factor 3，IRF3）磷酸化，磷酸化的IRF3 二聚體然后進入細胞核，同時STING 也激活激酶IKK（IκB kinase）促進NF-κB 的磷酸化，一起轉移進入細胞核，誘導干擾素和炎癥細胞因子表達（圖 1）［26，31，33-37］；同時在 STING 激活的下游也會導致NF-κB 的激活，但激活機制目前尚未明確。另外cGAMP還可通過細胞間的縫隙連接從一個細胞轉移到相鄰細胞，激活相鄰細胞STING擴大信號的傳導。

圖1 cGAS-cGAMP-STING信號通路示意圖［37］Fig.1 Schematic diagram of cGAS-cGAMP-STING sig?nal pathway［37］

3 cGAS的生物學功能

cGAS-STING 途徑在引發針對各種微生物病原體的有效免疫中的關鍵作用已被普遍證明［38-39］，此外研究報道證明cGAS 在自噬中也發揮作用，cGAS是可將錯誤定位的DNA 監測為危險相關分子模式（DAMP），并誘導Ⅰ型IFN 和其他細胞因子表達的傳感器［6］，且胞質 DNA 傳感途徑已成為 DNA 損傷與先天免疫間的主要聯系?，F將主要論述cGAS 在自噬、DNA損傷、細胞衰老和癌癥中的功能。

3.1 cGAS在自噬中的作用 自噬是一種溶酶體降解途徑，對生存、分化、發育和體內平衡至關重要。自噬主要起適應性作用，以保護生物體免受各種病理學侵害，包括感染、癌癥、神經變性和衰老等，且也有相關研究證明自噬在病毒免疫中發揮作用［40-41］。WATSON 等［42］在 2012 年首次報道細胞外結核分枝桿菌胞質DNA 觸發了STING 依賴性微生物向自噬體的傳遞，證明胞質DNA 與自噬間存在聯系，但其基本機制仍不明確。2014年LIANG 等［43］研究證明含 Mab-21 結構域的 cGAS（MB21D1/cGAS）與Beclin-1 自噬蛋白間具有直接的相互作用關系，說明細胞內DNA 傳感途徑與自噬機制間的相互作用，這種相互作用不僅抑制了MB21D1 的酶促活性以阻止cGAMP的產生，還增強了自噬介導的胞質微生物DNA 的降解，表明MB21D1是細胞內DNA 傳感途徑與自噬途徑間的分子聯系。LIANG 等［44］還證明cGAS 與Beclin-1 的結合是通過雙鏈DNA 刺激或DNA 病毒感染引起的，二者的有效結合取決于cGAS 的 DNA 結合活性，且 cGAS 和 Beclin-1 間的交叉調控與cGAMP-STING 無關，是位于cGAMPSTING 的上游信號事件，說明STING 的表達對cGAS-Beclin-1 相互作用不是必需的。cGAS 和Be?clin-1 的相互作用使cGAS 競爭性結合Beclin-1 的中央結構域CCD，最終從Beclin-1自噬復合體釋放Ru?bicon（PI3KC3 復合物亞基，自噬負調控因子），導致PI3KC3（磷脂酰肌醇3-激酶Ⅲ類）活性受到抑制，從而阻斷了自噬的成熟步驟［45-46］，導致PI3KC3 激活并誘導自噬以去除胞質病原體DNA，在宿主免疫應答的后期，cGAS 可能在 STING 介導的 IFN 途徑和 Be?clin-1 介導的自噬途徑間穿梭，以引起IFN 產生，同時誘導自噬介導的DNA 降解以防止cGAS 過度激活和避免持續的免疫刺激。因此，cGAS 作為胞漿DNA 傳感器協調干擾素和自噬途徑，最終優化宿主抗微生物活性的時間和效率，以響應各種環境刺激和感染。

陳志堅團隊發現STING 在結合cGAMP 后，含有STING 的內質網-高爾基體中間隔室（endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment，ERGIC）是LC3 脂質化的膜來源，蛋白質LC3 是自噬小體的關鍵標志物，通過LC3 脂質轉移到正在生長的自噬小體上，這是自噬體發生的關鍵步驟［47］。同時該研究發現cGAMP 誘導的自噬對細胞質中DNA 和病毒的清除很重要。有趣的是，?？械腟TING 在cGAMP刺激下可誘導自噬，但不誘導干擾素表達，證明誘導自噬是cGAS-STING 通路的原始功能［48］。盡管細胞內DNA 傳感途徑和自噬途徑間的分子聯系在對病原體的平衡免疫防御中起至關重要的作用，但其相關機制有待進一步研究。

3.2 cGAS 在DNA 損傷的作用 正常情況下的所有哺乳動物中，DNA 緊密地包裹在細胞核內受到保護，不會自由移動，cGAS在細胞中處于休眠狀態，當機體受到某些威脅時，如細胞的自身損傷或有入侵細胞的病毒或細菌時，DNA 片段“離開”細胞核，以微核的形式導致細胞質中的DNA 積累［49-51］。cGAS被募集到微核中，與DNA 損傷的標記物（例如磷酸化組蛋白）在微核中共定位，微核中的cGAS 可能被染色體DNA 激活以合成cGAMP，激活相應信號通路［52］。cGAS 對 DNA 損傷也并不僅局限于微核內，LIU 等［53］研究發現 cGAS 在 DNA 損傷后移位到核中，并與DNA 雙鏈斷裂的位置結合在一起，然而核cGAS 沒有激活酶的催化和cGAMP 的產生，而是與DNA 損傷位點相關聯，抑制了DNA 修復過程，該研究提出，抑制cGAS轉運和將cGAS定位于DNA 雙鏈斷裂的方法是最小化DNA 損傷并增強DNA 修復的機制。cGAS 能夠監測到細胞質DNA 并做出反應的原因就是核DNA損傷通過cGAS識別破裂的微核，將基因組不穩定性與先天性免疫反應聯系在一起，但cGAS在DNA修復中的潛在作用仍然是未知的。

3.3 cGAS在細胞衰老中作用 細胞衰老是由各種不同的壓力觸發的，并以永久性細胞周期停滯為特征。衰老細胞分泌多種炎癥因子，統稱為衰老相關的分泌表型（senescence-associated secretory pheno?type，SASP），SASP 不僅充當衰老的標志，而且參與衰老過程。通過SASP 的自分泌和旁分泌作用，衰老細胞會嚴重影響許多生物學過程，包括傷口愈合、組織修復、腫瘤發生［54-56］。最近的研究證明cGAS 在促進細胞衰老中也具有重要作用［57］。GLUCK 等［58］研究發現cGAS的激活基于其對異常胞質染色質片段（CCFs）的識別，cGAS 激活后通過STING 觸發SASP 因子的產生，從而促進旁分泌衰老，同時發現細胞衰老的各種觸發因素包括氧化應激、致癌基因信號、輻射和促衰老藥物等都參與cGAS-STING 途徑來驅動炎癥性SASP 成分的產生，cGAS 對胞質染色質片段的先天免疫感應可促進衰老?？傊?，這些發現通過cGAS-STING 途徑建立了內源性DNA 監測，并作為衰老和SASP 的重要調節劑。YANG 等［59］發現 DNA 與細胞質中的 cGAS 結合，激活 cGAS 以應對 DNA 損傷，cGAS 不僅與細胞周期中細胞核染色質DNA 相關，也與細胞質中受損DNA 相關，這引起了一個可能性，即cGAS 可能通過STING依賴性機制調節細胞周期和衰老，但cGAS如何調節細胞周期和細胞衰老尚未明確，但依賴cGAS的SASP 基因表達可能有助于細胞衰老模型的建立，且cGAS 抑制劑可能對治療和細胞衰老或年齡有關的疾病中有益。以上研究結果表明，cGAS 是DNA 損傷、SASP 基因表達和衰老間的重要分子聯系［60-61］。

3.4 cGAS在腫瘤中的的作用 因為基因組的不穩定性，cGAS-STING 在腫瘤作用中有兩面性，一方面是該途徑有助于抗腫瘤免疫，是阻止惡性腫瘤的內在屏障，癌細胞固有的cGAS 對于通過先天性和適應性免疫控制腫瘤至關重要；另一方面，該途徑可促進炎癥驅動的癌變和轉移［62］。

DNA 損傷通常發生于癌癥早期階段，其可觸發cGAS-STING 途徑誘導干擾素產生［63］。雖然長期激活cGAS-STING 具有致癌作用，但cGAS-STING 信號在免疫介導的惡性細胞清除中起重要作用，cGASSTING可作為候選藥物靶標治療癌癥和其他疾病的自身 DNA 引起的炎癥［64］。研究證明 DNA 雙鏈斷裂是細胞染色體復制過程中最嚴重的一種DNA 損傷，修復功能缺陷可能造成兩種結果：一是細胞死亡；二是發生基因突變或進而惡性轉化為腫瘤細胞［65］。然而已癌化細胞DNA修復能力增強，使用聚ADP核糖聚合酶1（PARP-1）抑制劑或者PARP-1 基因敲除能降低腫瘤細胞的DNA 修復功能，增強其對DNA損傷因子敏感性，同源重組缺陷細胞對PARP 抑制劑有較高的敏感性是具有臨床研究意義一種DNA修復途徑。研究證實cGAS 抑制小鼠和人類模型中的同源重組［53］，DNA 損傷以一種依賴于輸入蛋白-α的方式，將cGAS 從細胞質轉運到細胞核中的DNA雙鏈斷裂位點上，并通過聚腺苷二磷酸核糖與PARP-1 相互作用，抑制同源重組，此研究證明在體外和體內降低cGAS 基因表達會抑制DNA 損傷和腫瘤生長，因此認為細胞核中的cGAS 抑制同源重組介導的修復，并促進腫瘤生長，cGAS 代表癌癥預防和治療的一種潛在的靶標。越來越多的證據表明，cGAS-STING 途徑至少對3 種主要的癌癥療法（放射療法、化學療法和免疫療法）具有重要作用，是一種新希望的藥物靶點。

4 小結與展望

現已公認cGAS 是微生物病原體的主要傳感器，通過一系列的研究已經建立了該DNA 傳感途徑的基本框架和機制，但調控細節仍需進一步完善。新的研究闡明了cGAS 在監測DNA（在病理條件下錯誤定位到細胞質）中的重要作用，所有細胞和組織都含有可能引發炎癥的“危險”DNA，因此cGAS途徑可能在涉及炎癥的許多常見疾病中起作用，將基因組不穩定性與天然免疫應答聯系起來，為腫瘤的治療提供新的策略，啟發研究者利用該通路的激活劑提高抗腫瘤免疫，開發新一代腫瘤的免疫治療法，調節cGAS 活性可能是治療與衰老相關的人類疾病的新思路［66］。開發有效、特異性的cGAS 激動劑或抑制劑是未來科學研究的重要方向，且其不僅作為研究工具十分有用，作為治療多種人類疾病的潛在治療劑也具有很大價值。