乳化劑對(duì)葡萄酒活性干酵母發(fā)酵性能的影響研究

張 衡，熊 濤，覃先武，盧 發(fā)，匡金寶，許引虎

（1.湖北省酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌443003； 2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

酵母應(yīng)用史和人類的發(fā)展史一樣源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，在人類的社會(huì)生活中扮演著重要角色[1]。在釀酒行業(yè)，葡萄酒領(lǐng)域是規(guī)模化使用活性干酵母時(shí)間最早、范圍最廣、技術(shù)最成熟的行業(yè),在20世紀(jì)60年代初,歐美各國(guó)的葡萄酒產(chǎn)區(qū)均已開始使用葡萄酒活性干酵母。我國(guó)從20世紀(jì)80年代末開始接觸葡萄酒活性干酵母，在1997年，由位于中國(guó)湖北宜昌的中國(guó)食用酵母基地（現(xiàn)安琪酵母股份有限公司）推出了中國(guó)第一個(gè)本土葡萄酒活性干酵母1450，填補(bǔ)了中國(guó)本土葡萄酒活性干酵母的空白[2]。商業(yè)化活性干酵母具有方便儲(chǔ)存、運(yùn)輸快捷、使用操作靈活等綜合優(yōu)點(diǎn)，在活性干酵母的生產(chǎn)過程中會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行脫水干燥處理，最終制成的活性干酵母含水量在4.0%～8.0%之間[3]。在酵母生產(chǎn)的干燥脫水環(huán)節(jié)，會(huì)采用多種物理和生物工程技術(shù)，使酵母細(xì)胞失去所有的自由水和大部分的結(jié)合水，水分的缺失導(dǎo)致細(xì)胞膜水化層的喪失，為了避免葡萄酒酵母在干燥過程中的損傷，傳統(tǒng)工藝會(huì)選擇添加適量的乳化劑來保護(hù)酵母細(xì)胞，使活性干酵母產(chǎn)品達(dá)到相應(yīng)的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，滿足食品發(fā)酵的技術(shù)需要[4]。2000—2010年中國(guó)葡萄酒產(chǎn)量保持了年均20%的復(fù)合增長(zhǎng)率，在2010年突破了100萬t[5]。工業(yè)生產(chǎn)中葡萄酒活性干酵母起酵速度過快，葡萄汁泡沫極其豐富，有很大的葡萄汁溢出風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)探索酵母細(xì)胞在脫水干燥的后處理過程中乳化劑對(duì)葡萄酒活性干酵母在發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞形態(tài)、活細(xì)胞數(shù)、葡萄酒的發(fā)酵周期、最終的發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量、起酵速度等方面的影響。目的是在不影響發(fā)酵周期和葡萄酒最終品質(zhì)前提下降低葡萄酒活性干酵母在發(fā)酵過程中的起酵速度，以防止發(fā)酵過快的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌種：釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)RV002，由安琪酵母股份有限公司生物技術(shù)研究院菌種庫(kù)提供。

試劑：糖蜜、乳化劑、酵母抽取物、硫酸鎂、硫酸鋅等，均由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)技術(shù)中心提供。

儀器設(shè)備：BK1301生物顯微鏡，南京庚辰科學(xué)儀器有限公司；NRY-2110恒溫?fù)u床，上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；HDS-16-5鹵素電子水分儀，上海方瑞儀器有限公司；C20-2小型自動(dòng)發(fā)酵罐，德國(guó)貝朗公司；TDL-40B高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；J26XP高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司；WBF-2G小型干燥床，重慶英造粒包衣技術(shù)格有限公司；E-50小型造粒機(jī)，重慶英造粒包衣技術(shù)格有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)

種子搖瓶培養(yǎng)：蔗糖100 g、酵母抽取物FM888 20 g、硫酸鎂、磷酸二氫鉀適量，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值，在180 r/min、30℃的搖床中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 酵母的發(fā)酵

底物滅菌：將適量的MgSO4、ZnSO4、酵母抽取物定容至9 L，添加酸堿液調(diào)節(jié)pH值，121℃滅菌30 min。

接種：在無菌的條件下將1.2.1中的1 L種子搖瓶培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中。

發(fā)酵：用糖蜜作為碳源，硫酸銨作為氮源，磷酸二氫銨作為磷源進(jìn)行發(fā)酵。pH值控制在3.3～6.8，轉(zhuǎn)速在300～600 r/min，通風(fēng)量控制在8～40 L/min，溫度控制在29～36℃，等待酵母成熟后進(jìn)行吹風(fēng)，留酵母樣進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)[6]。

1.2.3 酵母的干燥[7]

干燥工藝流程：酵母乳添加乳化劑/不添加乳化劑→過濾→造粒→干燥。

操作要點(diǎn)：

①酵母乳的過濾：乳化劑用80～90℃的熱水配制,可按每100 L水里加12.5 kg配制，配好后保持65～70℃在壓濾之前加入酵母乳中(加入的百分比為酵母乳折干后的百分比)，并保證混合均勻。

②板框壓濾：板框壓濾后的酵母塊水分在65%以下。

③干燥：進(jìn)入干燥床的空氣濕度小于6 g/kg。進(jìn)風(fēng)溫度控制在60℃，物料品溫控制在52℃，干燥時(shí)間30 min。

1.2.4 干酵母指標(biāo)檢測(cè)

蛋白質(zhì)、五氧化二磷、海藻糖、其他微量成分的檢測(cè)參考安琪酵母股份有限公司Q/YB.J 06.101—2016《酵母生產(chǎn)過程分析方法》。

1.2.5 酒樣常規(guī)理化指標(biāo)測(cè)定

酒精、殘?zhí)恰⒖偹帷]發(fā)酸的測(cè)定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析法》。

1.2.6 模擬葡萄汁配制

模擬葡萄汁配制，參考OIV國(guó)際技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制，培養(yǎng)基由儲(chǔ)液A、儲(chǔ)液B、儲(chǔ)液C三部分組成。

儲(chǔ)液A：在375 mL蒸餾水中加入蔗糖240 g/L定容至500 mL。

儲(chǔ)液B：在250 mL蒸餾水中加入6 g/L酒石酸、3 g/L蘋果酸、0.5 g檸檬酸。

儲(chǔ)液C：在250 mL蒸餾水中加入6 mg肌醇、0.2 g氯化鈣、1.7 g YNB（參照表1），以及氮源（1 g/L DAP，1 g/L FM888）。

表1 YNB培養(yǎng)基 (μg/L)

將儲(chǔ)液A、B、C混合后用4 mol/L氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH3.5。

1.2.7 活性干酵母發(fā)酵性能檢測(cè)

采用250 mg/L的接種量，將稱量好的活性干酵母提前放入10 mL的試管中，按照常規(guī)活化工藝規(guī)程，加入10倍酵母質(zhì)量的38℃去離子水，使葡萄酒活性干酵母溶解完全[8]，將帶有復(fù)水活化液的試管放入38℃的恒溫水浴鍋中活化20 min，再逐步加入少量的葡萄汁模擬汁，待酵母活化液的溫度降至與葡萄模擬汁溫差在10℃以內(nèi)時(shí)，將酵母活化液接種到裝有葡萄汁模擬汁的500 mL三角瓶中，每瓶裝250 mL葡萄模擬汁，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)[9-10]。

1.2.8 發(fā)酵過程中細(xì)胞形態(tài)的觀測(cè)

發(fā)酵過程中每24 h取1 mL發(fā)酵液用顯微鏡觀察酵母的形態(tài)并拍照記錄，觀察發(fā)酵酵母細(xì)胞大小、細(xì)胞形狀、出芽率、內(nèi)含物、液泡等形態(tài)的改變[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酒活性干酵母理化指標(biāo)的檢測(cè)

從表2可知，不加乳化劑和加乳化劑的活性干酵母在蛋白質(zhì)、五氧化二磷以及海藻糖方面差距在2%以內(nèi)，無顯著性差異。未加乳化劑的酵母細(xì)胞總數(shù)比加乳化劑的細(xì)胞總數(shù)多4%，差距不顯著，在活細(xì)胞率方面，未加乳化劑的活性干酵母活細(xì)胞率比添加乳化劑的活細(xì)胞率少11%，有顯著的差異。可見，乳化劑對(duì)葡萄酒活性干酵母的活細(xì)胞率是存在顯著影響的。

表2 葡萄酒活性干酵母理化指標(biāo)對(duì)比

2.2 酵母干燥過程中加乳化劑和不加乳化劑發(fā)酵動(dòng)力的對(duì)比

從表3、表4和圖1可知：

表3 發(fā)酵過程中失重情況

表4 運(yùn)用minitab回歸模型方差分析

圖1 發(fā)酵每天失重差異性對(duì)比圖

（1）起酵速度的影響：添加乳化劑的酵母第1天失重在6.24 g，未添加乳化劑的酵母第1天失重在1.88 g，未加乳化劑酵母起酵速度是添加乳化劑起酵速度的30%，P值＜0.0001，差異極顯著，可見不添加乳化劑可以極顯著降低葡萄酒酵母的起酵速度。

（2）發(fā)酵峰值的影響：第3天葡萄酒酵母發(fā)酵達(dá)到峰值，其中未加乳化劑的酵母發(fā)酵失重為12.6 g/L，添加乳化劑的酵母失重為11.4 g/L，未加入乳化劑的酵母峰值大于加乳化劑酵母的峰值10%，P值0.051，差異性不顯著，可見未加乳化劑的葡萄酒酵母不會(huì)影響其在發(fā)酵過程中峰值的表現(xiàn)。

（3）對(duì)發(fā)酵時(shí)間的影響：添加乳化劑和未添加乳化劑的酵母均在7 d完成發(fā)酵（以每天失重小于1 g/L判斷發(fā)酵結(jié)束），可見對(duì)酵母發(fā)酵周期無影響。

綜上，不加乳化劑的活性干酵母的起酵速度會(huì)極其顯著的變慢，但對(duì)發(fā)酵峰值影響不顯著，對(duì)發(fā)酵周期沒有影響。

2.3 發(fā)酵過程中酵母的細(xì)胞數(shù)

從表5可以看出，第1天未加乳化劑的酵母和加乳化劑的酵母的活細(xì)胞數(shù)相差14%，差異顯著。但從第2天直至發(fā)酵結(jié)束，酵母的活細(xì)胞數(shù)趨于一致，經(jīng)minitab計(jì)算P值為0.985，無顯著的差異，且與發(fā)酵應(yīng)用中驗(yàn)證一致。

表5 發(fā)酵過程中細(xì)胞數(shù)目的變化 (×107個(gè)/mL)

從顯微鏡中可以看出發(fā)酵第1天為酵母主要的出芽時(shí)間，隨后酵母出芽較少甚至沒有觀察到，出芽率與酵母活細(xì)胞數(shù)的趨勢(shì)一致，出芽率越高的細(xì)胞數(shù)越大，發(fā)酵第7天觀察到酵母未加乳化劑和加入乳化劑的死亡率分別為14.73%、15.57%。在發(fā)酵過程中，酵母未加乳化劑和加入乳化劑的形態(tài)無明顯的差異，酵母在發(fā)酵過程中出現(xiàn)幾乎是圓形形狀、大小不均一，最終細(xì)胞數(shù)目?jī)烧邘缀跻粯印？梢姡湍父稍镞^程中未添加乳化劑對(duì)酵母在發(fā)酵過程中的形態(tài)和最終活細(xì)胞數(shù)目無顯著影響。

2.4 發(fā)酵完成后模擬葡萄酒的常規(guī)理化檢測(cè)

從表6可知，通過葡萄模擬汁的常規(guī)理化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩者的殘?zhí)蔷? g/L以下[12]，均能完成發(fā)酵，最終發(fā)酵的葡萄模擬汁酒精度、揮發(fā)酸、總酸、pH值均無顯著差別。

表6 葡萄酒常規(guī)理化指標(biāo)

未加乳化劑酵母發(fā)酵的模擬汁和加入乳化劑的酵母發(fā)酵模擬汁最終酒的理化指標(biāo)無明顯差異，感官小組的評(píng)定是兩者的感官無明顯差異，可見未加乳化劑的活性干酵母不會(huì)影響葡萄酒的品質(zhì)。

3 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中未加乳化劑會(huì)降低葡萄酒活性干酵母活細(xì)胞數(shù)，但在發(fā)酵開始后的第2天直至發(fā)酵結(jié)束兩者的活細(xì)胞數(shù)目趨于一致，活細(xì)胞數(shù)目無顯著的差異。也不會(huì)影響葡萄酒酵母在發(fā)酵過程中形態(tài)、最終活細(xì)胞數(shù)目、葡萄酒的發(fā)酵周期、葡萄酒模擬汁理化指標(biāo)，且通過感官小組的評(píng)定葡萄模擬汁的品質(zhì)無明顯差異。

未加乳化劑的活性干酵母起酵速度是添加乳化劑發(fā)酵速度的30%，不添加乳化劑的活性干酵母可以極顯著降低葡萄酒酵母的起酵速度，這樣可以降低葡萄酒生產(chǎn)過程中第1天的發(fā)酵速度，減少葡萄汁泡沫的生成從而降低葡萄汁溢出的風(fēng)險(xiǎn)。