水稻稻瘟病抗性基因及稻瘟病菌無毒基因研究進展

張麗麗，桑海旭，馬曉慧，毛 艇，闕補超，王紹林，張 戰，于深州，李春泉

（遼寧省鹽堿地利用研究所，遼寧 盤錦 124010）

水稻（Oryza sativa L.）是世界重要的糧食作物之一，也是我國重要口糧作物，水稻生產在確保我國糧食安全上具有重要地位，2017 年以來，我國每年水稻種植總面積達3 020 萬hm2，產量達2億t 以上[1-3]。 稻瘟病是由子囊菌引發的水稻真菌病害，是水稻生產上最為重要的病害之一，每年可引起大幅度減產，嚴重時甚至顆粒無收，對水稻產量和品質都造成嚴重影響[4-5]。 研究發現，近20 年稻瘟病病害呈現不斷上升趨勢[6]。 近年來，我國水稻稻瘟病年平均危害面積在7 500 萬hm2左右，每年因此損失的水稻產量高達數億公斤[7]。目前水稻生產中主要通過種植抗性品種和化學防治來降低稻瘟病的危害，但是化學防治方法費用較高，且易對環境造成污染[8]。隨著水稻和稻瘟病病菌的基因測序工作的基本完成， 結合水稻與稻瘟病菌互作的基因對基因假說，關于稻瘟病抗性基因、稻瘟病菌無毒基因的研究取得顯著進展， 為水稻抗稻瘟病分子標記輔助育種、 基因工程育種及稻瘟病綠色防治提供了廣闊的前景。

1 水稻稻瘟病菌侵染機制

隨著分子技術快速發展， 國內外學者對稻瘟病的侵染過程有了更深入了解， 其侵染路徑逐步清晰明了，尤其在分子水平上有關酶及蛋白的響應、 植物激素防御反應信號傳導途徑等方面，取得了大量研究成果[9-11]。 侵染過程主要分為兩個階段。

第一階段是在細胞外形成附著胞[12]。 分生孢子是由三個隔間細胞組成的結構。 當分生孢子附著在寄主表皮細胞上以后， 尖端的芽孢及它分泌的粘膠就會粘在植物細胞表面， 接著分生孢子利用本身細胞內的營養物質在其頂端的細胞萌發形成極化的發芽管，這一步叫做“掛鉤”，是病菌對可侵染植株的識別階段[13]。 發芽管繼而特異性分化產生有黑色素的附著胞， 黑色素是很大一部分致病菌毒性的特征， 這些黑色素可以減少紫外線對病菌的傷害，或者作為一種毒性代謝物[14]。 同時發現只有在植物細胞疏水性的表面才可以產生附著胞， 且需要MAP 激酶、cAMP 應答途徑以及植物幾丁質的參與[15]，同時會發生分生孢子的自我吞噬現象，且容易受外界溫度的影響。

第二階段主要是涉及菌絲在植物細胞內的形態發生。當附著胞形成后，本身會由于甘油的累計而膨脹，最終會在附著胞的底部產生一個“侵入釘”，這個“侵入釘”內部含有大量的微絲、微管，利用物理壓力穿透寄主組織的角質層和表皮細胞壁[16]。“侵入釘”侵入細胞內后，首先在非原生質體上分化為管狀的初始菌絲，最終形成胞內侵入菌絲，這時的水稻細胞仍未被殺死，這種狀態叫做活體營養[17]。 菌絲通過胞間連絲向周圍的健康細胞擴散，直到水稻細胞死亡。當病菌在水稻細胞內大量繁殖時，它能調節營養供應體系，使自身的繁殖不受制約， 同時產生大量有毒物質毒害細胞。5～7 d 后， 就有大量的分生孢子涌出并作為新的感染源感染周圍的植株。

2 水稻稻瘟病抗性基因定位與克隆

2.1 稻瘟病抗性基因定位

20 世紀60 年代，日本學者最先開展了稻瘟病抗性基因的研究， 并通過經典遺傳分析法鑒定出了多個稻瘟病抗性基因。隨后，國際水稻研究所和中國等產稻國也逐漸開展了相關研究， 大量的抗病基因不斷被鑒定。 國內外學者利用不同群體定位了多個抗稻瘟病基因， 例如Yu 等、Hayashi 等、Liu 等、Wang 等、Pan 等、Berruyer 等、Chen 等[18-24]。研究統計發現被定位的抗性基因來源于不同的野生稻資源和品種[25]。 目前定位的抗性基因分布在11 條染色體上（3 號染色體除外），大部分集中在第6、11 和12 這3 條染色體上，在第11 染色體定位了Pi2、Pil、Pil8、Pi7、Pi44、Pik 等多個基因。 在12 號染 色體 上存 在1 個 由Pi4、Pi6、Pi20、Pi21、Pi31、Pi32、Pitq6、Pita 和Pita2 等多抗性基因組成的抗病基因簇，具有顯著的廣譜抗性[26-27]。 廣譜抗性基因Pi9 被定位在第6 條染色體短臂上， 它首次是從小粒野生稻導入栽培稻中被發現， 并對不同國家的43 個稻瘟病菌表現出高抗[28-29]。 Pi40 也是具有廣譜抗性的基因， 它對來自韓國和菲律賓的多個菌株表現出較高抗性[30]。 此外，Huang 等[31]利用抗性品種將Pi47 定位在第11 染色體，Deng等[32]定位了廣譜抗性的Pigm，對來自中國的9 個生理小種表現出明顯抗瘟性。

2.2 稻瘟病抗性基因克隆

截止到目前， 鑒定的抗稻瘟病基因已超過100 個，已克隆的36 個[33]，被分為四類：①NBSLRR 類蛋白， 例 如Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、Pi25、Pi35、Pi36、Pi37、Pi40、Pi56、Pi64、Pi-ta、Pib、Piz-t、Pikm、Pit、Pid3、Pish、Pik、Pik -p、Pia、Pigm、Pb1、Pi -CO39、Pi63、Pid3-A4、Pi54rh、Pi54of 和Pike 等29個抗性基因[27]。②RLK 類蛋白，例如Pid2，它位于第6 號染色體，且有多個等位基因，克隆自水稻品種地谷，屬于組成型表達的單拷貝顯性基因。Pid2通過單個氨基酸差異區別抗感基因[34]。③富含脯氨酸結構域蛋白，例如Pi21。 Pi21 是一個隱性基因[35]，其編碼蛋白結構域共有5 個富含脯氨酸的區域，它的抗性來源于蛋白功能的失活[36]。 ④富含ARM 重復序列蛋白，例如Ptr。 Ptr 編碼一個非典型的廣譜抗性蛋白, 包含4 個Armadillo 重復區，Ptr 的抗性與Pita 和Pita2 有關， 研究還發現，該基因是單子葉植物所特有的[37]。 ⑤TPRs 類蛋白，例如Bsr-k1，該基因具有對稻瘟病和白葉枯病雙重抗性，主要原因是Bsr-k1 功能喪失，同時它還是一個具有廣譜抗性的隱性基因[38]。

3 稻瘟病菌無毒基因

水稻與稻瘟病菌之間的特異互作關系符合經典的基因對基因學說[39]。 無毒基因（AVR）是一類能夠誘發植物產生抗病性的病原物遺傳因子，在稻瘟菌與水稻互作中， 無毒基因的作用是轉錄翻譯成無毒蛋白質，然后被水稻細胞內的R 基因識別進而產生抗性[40]。 目前已鑒定且與抗性基因相對應的無毒基因共24 個，12 個基因被克隆。 例如Avr-Pita、ACE1、Avr-Pizt、Avr-Pia、Avr-Pii、Avr-Pik/km/kp、PWL1、PWL2、Avr-Pi9 等，其中只有前兩種基因不參與編碼分泌蛋白[41-42]。 目前，Pi-ta、Piz-t、Pik、Pia、Pi-CO39、Pi54、Pii、Pi9 和Pib 等抗性基因相對應的無毒基因已被克隆， 而且絕大多數抗性—無毒蛋白分子互作關系已明晰， 分直接互作和間接互作兩類。 其中直接互作包括：①抗病蛋白和無毒蛋白的一一對應。 例如Pi-ta 與AVR-Pita 和Pi54 與AVR-Pi54， 其中Pi-ta 與AVR-Pita 間的互作跟抗性蛋白Pi-ta 的LRR 結構域變化有關，二者均為直接互作，差異在于Pita 的防御應答條件[42-43]。 ②兩種抗性蛋白對應一個無毒基因。 例如Pik，研究表明Pik 由兩個蛋白組成（Pik-1 和Pik-2），Pik-1 可跟AVR-Pik 直接互作， 但Pik-2 不能獨自作為AVR-Pik 的受體，必須以復合體的形式才能參與防御反應[44]。 值得關注的是， 抗病基因Pik 和無毒基因的AVR-Pik各自都有不同數量的等位基因， 而且不同抗病基因和無毒基因間可相互識別， 表明抗性基因和無毒基因間等位基因的相伴存在， 闡明抗病基因與無毒基因之間的協同進化機制。③成對的抗病蛋白跟多個無毒基因互作。例如Pia，Pia 的兩個成員RGA4 和RGA5， 二者在參與調控防御反應時，只有RGA5-A 與AVR-Pia 或AVR1-CO39 互作，且RGA5 中RATX1 域在與無毒基因作用時發揮重要作用[45]。

4 展望

目前，隨著分子生物學的快速發展，水稻抗性基因鑒定、 克隆及水稻—稻瘟病互作機制的研究取得了顯著進展。截止目前，鑒定和克隆了大量的抗性基因和無毒基因， 并對二者間的互作機制進行了深入解析， 這些基因為抗稻瘟病育種提供了新思路和新材料。 很多研究者把已知抗性基因運用到抗稻瘟病育種實踐中， 并獲得了一批具有廣譜抗性又高產的水稻新材料， 已在農業生產中被廣泛利用[46-48]。 由于水稻與稻瘟病菌之間存在著極其復雜的互作關系， 稻瘟病菌侵害促進了水稻抗性基因的進化與形成， 而外界自然因素的影響又迫使稻瘟病菌不斷突變以應對水稻的防御，同時大量抗性基因也未得到充分利用，目前的研究，也只是冰山一角， 為了進一步解析水稻與稻瘟病菌的互作機理， 更加高效地利用抗性基因為稻瘟病抗病育種服務， 以下幾方面還需要開展進一步研究：①繼續開展抗性基因與無毒基因互作的分子機理研究， 探明二者互作的下游信號途徑。 ②繼續解析水稻廣譜抗性基因的分子機理， 為基因的利用提供理論依據。 ③開發更有效、與抗性基因緊密連鎖的分子標記， 促進抗性基因在育種中的利用，提高育種分子化水平。 ④挖掘抗稻瘟病種質資源，發掘新的抗稻瘟病基因。充分利用分子標記輔助育種技術、 轉基因技術和基因編輯技術等作物育種技術，簡化育種程序，提升育種效率，獲得更多的廣譜抗性新品種， 切實提高我國的稻瘟病綠色防控水平。