苦蘵P450家族基因鑒定與表達(dá)分析

蔣智芳，韓怡蝶，樓盼盼，郭 宏，馮尚國(guó)，沈晨佳，王慧中，*

(1.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121； 2.浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311121)

苦蘵(PhysalisangulataL.)是我國(guó)一種傳統(tǒng)的藥用植物，屬于茄科酸漿屬一年生草本植物，在中國(guó)大部分省份都有分布，具有消腫散結(jié)、利尿解毒與抗腫瘤等功效[1]。對(duì)苦蘵的藥理研究中，實(shí)驗(yàn)證明，酸漿苦味素(physalin)B、F和G能夠抑制巨噬細(xì)胞的活化，其中，physalin B還能夠抑制內(nèi)毒素引起的細(xì)胞死亡[2]?？嗵u中睡茄內(nèi)酯類(withanolide)化合物具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[3]。從苦蘵全株乙醇提取物中分離的多種酸漿苦味素，在體外試驗(yàn)中對(duì)5種人腫瘤細(xì)胞株(肝癌HA22T、直腸癌Colo-205、肺癌Calu-1、鼻咽癌KB、宮頸癌HeLa)和3種動(dòng)物腫瘤細(xì)胞株(喉表皮癌Hep-2、黑素瘤H1477、神經(jīng)膠質(zhì)瘤8401)有較好的抑制效果，而且對(duì)肝癌腫瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制作用最為突出[4-5]。

細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450)是一類廣泛分布于動(dòng)物和植物體內(nèi)的血紅素蛋白[6]。P450酶系的組成包括細(xì)胞色素P450、NADPH-細(xì)胞色素P450、氧化還原酶(CPR)、細(xì)胞色素b5、NADH-細(xì)胞色素b5、還原酶(CBR)和磷脂等。其中，最主要的就是細(xì)胞色素P450蛋白，作為P450酶系組成中的末端氧化酶，其關(guān)系著P450酶系中底物的差異性和廣泛性[7]。細(xì)胞色素P450酶系是植物中最大的超家族，負(fù)責(zé)植物天然產(chǎn)物的生物合成與有害物質(zhì)的降解，不僅為植物的生長(zhǎng)發(fā)育保駕護(hù)航，還參與到各種藥用成分合成的代謝中[8]。通過(guò)對(duì)P450基因表達(dá)的調(diào)控，可以影響生物體內(nèi)代謝途徑，改變次生代謝產(chǎn)物的性質(zhì)和數(shù)量[7]。有研究表明，果實(shí)中存在眾多苦蘵活性成分[9]，成熟果實(shí)是目前提取分離活性成分的主要植物材料。

研究P450家族基因在苦蘵成熟過(guò)程中的表達(dá)差異及其對(duì)乙烯的響應(yīng)，有助于更好地理解P450家族成員的生物學(xué)功能及其在果實(shí)形成過(guò)程中的作用?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究鑒定了一系列P450酶編碼基因，并分析了其組織特異性表達(dá)譜。通過(guò)分子手段，克隆了3個(gè)在果實(shí)中特異表達(dá)的P450家族基因全長(zhǎng)序列，進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析。

1 材料與方法

1.1 材料

苦蘵材料取自浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫室大棚，大腸埃希菌為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種DH5α，超表達(dá)載體pDL28-DHA、GFP1300亞細(xì)胞定位載體、克隆載體pMD19-T購(gòu)自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試劑

T4 DNA連接酶、T緩沖液10×、BSA(10×)、KpnⅠ、SalⅠ、PrimeSTAR Max DNA PolymerasePCR、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMDTM19-T Vector Cloning Kit均購(gòu)于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、Trizol均購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 苦蘵RNA提取(trizol法)與cDNA模板的合成

取苦蘵不同組織部位，trizol法提取其總RNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。合格的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ每嗵uactin引物PCR擴(kuò)增cDNA，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)cDNA質(zhì)量。

1.4 目的基因克隆

選取3個(gè)果實(shí)特異表達(dá)P450家族基因comp164210、comp131532、comp152181，基于其全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，并在引物末端添加KpnⅠ、SalⅠ酶切識(shí)別位點(diǎn)，引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。PCR擴(kuò)增目的基因(TaKaRa，PrimeSTAR Max DNA PolymerasePCR)，反應(yīng)體系20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s 或15 s，72 ℃ 90 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并用膠回收試劑盒(TaKaRa，MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)回收PCR產(chǎn)物。按試劑盒說(shuō)明書在PCR產(chǎn)物3′端添加dA堿基，形成黏性末端并回收反應(yīng)產(chǎn)物。把純化的目的片段與T載體連接(TAKaRa，pMDTM19-T Vector Cloning Kit)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)DH5α中，然后在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h左右。挑選單菌落，將其擴(kuò)大培養(yǎng)，用一代測(cè)序技術(shù)確認(rèn)目的基因序列。

表1 苦蘵P450基因擴(kuò)增引物

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將P450家族基因的核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，利用ClustalX1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，然后將得到的結(jié)果導(dǎo)入MEGA6.0中，采用Neighbor-Joining (NJ)法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.6 GFP亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建

用相同的限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、SalⅠ將測(cè)序正確的質(zhì)粒和pCAMBIA1300-GFP亞細(xì)胞定位載體進(jìn)行雙酶切，37 ℃酶切6 h，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收。使用T4 DNA連接酶將目的片段與亞細(xì)胞定位載體GFP1300 16 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)DH5α中，然后在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h左右。挑選單菌落，將其擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行質(zhì)粒提取。采用雙酶切法鑒定質(zhì)粒連接情況，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7 熒光定量PCR方法

采用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析苦蘵P450家族基因在果實(shí)不同成熟期的表達(dá)譜。具體操作按說(shuō)明書(Takara， SYBR qPCR Mix kit)進(jìn)行。以滅菌雙蒸水為模板，作為空白對(duì)照，以苦蘵actin為內(nèi)參基因，所有實(shí)驗(yàn)均在ABI7500熒光定量?jī)x上進(jìn)行。P450家族基因的相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算[10]。均采取3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)性重復(fù)。引物序列見表1。

1.8 乙烯與1-MCP處理

以坐果14 d的未成熟果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，將果實(shí)于10 μmol·L-1ACC和10 μmol·L-11-MCP中浸泡3 h取出，用ddH2O漂洗3次后，于液氮中保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的P450編碼基因分析

分別取根、莖、葉、花和果實(shí)，提取總RNA并進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序結(jié)果一共得到1.69×1010個(gè)堿基的原始數(shù)據(jù)。針對(duì)原始序列，利用Trinity軟件進(jìn)行de novo拼接，拼接得到604 473個(gè)unigene，鑒定得到795個(gè)注釋為P450家族基因的序列。

2.2 P450家族基因

分析P450家族基因的組織特異性表達(dá)，比較苦蘵根、莖、葉、花、果實(shí)5個(gè)主要器官，并使用轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)繪制基因表達(dá)譜，不同器官3個(gè)平行重復(fù)。結(jié)果(圖1)表明，P450家族基因在不同組織中的表達(dá)水平具有顯著差異。通過(guò)K-cluster技術(shù)，將795個(gè)可能的P450家族基因進(jìn)行聚類。通過(guò)比對(duì)分析，鑒定得到5個(gè)組織特異性表達(dá)基因群，分別命名為cluster Ⅰ-Ⅴ。cluster Ⅰ聚類了果實(shí)特異表達(dá)的P450基因，cluster Ⅱ中聚類了花特異表達(dá)P450基因，眾多的葉特異表達(dá)P450基因聚類于cluster Ⅲ中，根特異表達(dá)P450基因聚類于cluster Ⅳ，Cluster Ⅴ中包含的P450基因具有莖特異表達(dá)特點(diǎn)。

綠色表示低表達(dá)，紅色代表高表達(dá)。Green meant low expression， red meant high expression.圖1 苦蘵P450家族基因表達(dá)譜分析Fig.1 Expression spectrum analysis of P450 genes in Physalis angulate

2.3 P450家族基因全長(zhǎng)序列與進(jìn)化關(guān)系分析

前期注釋的795個(gè)可能的P450基因序列大部分只有一個(gè)片段，僅小部分基因可以拼接得到全長(zhǎng)序列。詳細(xì)分析每一個(gè)可能的P450基因的不同轉(zhuǎn)錄本，一共拼接得到37個(gè)全長(zhǎng)基因序列，經(jīng)BLAST分析，剔除部分注釋錯(cuò)誤基因，一共得到30個(gè)和其他物種高度同源的苦蘵P450家族基因的全長(zhǎng)序列。通過(guò)同源進(jìn)化分析，將這30個(gè)苦蘵P450基因分到了9個(gè)亞家族中，分別為：subfamily 71、subfamily 78、subfamily 73、subfamily 81、subfamily 89、subfamily 86、subfamily 97、subfamily 72和subfamily 88 (圖2)。這些P450基因的亞家族在模式植物中都有廣泛研究，通過(guò)同源進(jìn)化分析，有助于詳細(xì)研究苦蘵P450基因，以及其對(duì)次生代謝的調(diào)控機(jī)制，并為功能分析提供線索。

圖2 P450家族基因同源進(jìn)化分析Fig.2 Homologous and phylogenetic analysis of P450 genes

2.4 苦蘵不同成熟期P450家族基因表達(dá)譜分析

取苦蘵不同發(fā)育階段的果實(shí)RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)qRT-PCR分析具有全長(zhǎng)序列的P450家族基因相對(duì)表達(dá)水平，構(gòu)建其在果實(shí)成熟不同階段的表達(dá)譜。結(jié)果如圖3所示，大量P450家族基因在果實(shí)發(fā)育的不同階段表達(dá)水平不同，右側(cè)列出苦蘵中所有P450基因，紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因，黃色方框中是表達(dá)水平具有顯著差異的P450基因。聚類分析得到2類果實(shí)成熟期差異表達(dá)基因，A類為成熟抑制表達(dá)基因，B類為成熟誘導(dǎo)表達(dá)基因。9個(gè)A類P450基因隨著果實(shí)的成熟表達(dá)量顯著下降，包括comp149305，comp149118，comp135358，comp149434，comp163011，comp161690，comp148594，comp156481，comp146083；另9個(gè)B類P450基因則隨著果實(shí)成熟表達(dá)量顯著上升，包括comp163044、comp164210、comp161171、comp159411、comp148422、comp160203、comp131532、comp149459、comp154418。

圖3 P450家族基因在苦蘵果實(shí)不同成熟階段的表達(dá)水平Fig.3 Expression level of P450 genes at different ripe stages of fruit

2.5 乙烯信號(hào)調(diào)控P450家族基因表達(dá)

共有13個(gè)P450基因的表達(dá)水平對(duì)ACC和1-MCP具有不同的響應(yīng)模式，這些基因包括comp164210、comp161171、comp163044、comp160203、comp131532、comp149459、comp148442、comp135358、comp145182、comp149305、comp154418、comp152181、comp146083(圖4)。結(jié)合2.4節(jié)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分響應(yīng)乙烯處理的P450基因同時(shí)屬于2.4節(jié)的A類和B類基因。

2.6 三個(gè)果實(shí)特異表達(dá)P450家族基因全長(zhǎng)序列的克隆

從鑒定得到的30個(gè)具有全長(zhǎng)序列的P450家族基因中選取3個(gè)果實(shí)特異表達(dá)P450基因，分別為comp164210(subfamily78)、comp131532(subfamily81)、comp152181(subfamily89)，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到其基因片段，長(zhǎng)度在1 500 bp左右。通過(guò)與轉(zhuǎn)錄組拼接得到的序列比較，確定PCR所得序列分別為comp164210、comp131532、comp152181，結(jié)果如圖5所示。

圖5 三個(gè)果實(shí)特異表達(dá)P450基因的克隆Fig.5 Clone of three fruit-specific expression P450 genes

2.7 三個(gè)果實(shí)特異表達(dá)P450家族蛋白的亞細(xì)胞定位

選取上述3個(gè)果實(shí)特異表達(dá)P450基因comp164210、comp131532、comp152181，將構(gòu)建好的35S：P450：GFP載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，轉(zhuǎn)入苦蘵葉肉細(xì)胞。通過(guò)熒光共聚焦顯微鏡觀察上述3個(gè)P450蛋白的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果表明，3個(gè)P450蛋白在多種亞細(xì)胞器官中都有表達(dá)，其中，comp164210在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)量較高，comp131532在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上表達(dá)量較高，而comp152181在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)(圖6)。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)鑒定得到的3個(gè)P450基因縮碼的蛋白可能具有多種生物學(xué)功能。有意思的是，3個(gè)P450蛋白在細(xì)胞質(zhì)都有較高的表達(dá)水平，這一點(diǎn)與P450蛋白作為一種重要生物酶相一致。

圖6 苦蘵3個(gè)P450蛋白的亞細(xì)胞定位情況Fig.6 Subcellular localization of three P450 protein

3 討論

苦蘵作為一種歷史悠久的藥用植物，近年來(lái)其藥用價(jià)值得到了較多發(fā)掘，但是針對(duì)苦蘵代謝相關(guān)基因的研究尚且處于起步階段[11]。前期，本研究以浙江本地產(chǎn)的苦蘵為研究材料，通過(guò)Illumina HiSeq2500高通量測(cè)序得到了苦蘵的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)海量信息的分析可以更深入地研究苦蘵的藥理和代謝，為更好地開發(fā)利用苦蘵奠定基礎(chǔ)。當(dāng)前，圍繞苦蘵展開的組學(xué)研究尚且不多，本研究鑒定得到的604 473個(gè)unigene極大地?cái)U(kuò)展了苦蘵遺傳信息，為后續(xù)研究提供了一個(gè)苦蘵的功能基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)，使得克隆活性物質(zhì)合成相關(guān)基因成為可能。

P450基因超家族廣泛參與植物次生代謝過(guò)程，是多種藥用成分生物合成的關(guān)鍵酶編碼基因[12]。CYP450參與眾多的酶催化反應(yīng)，是苯丙烷類、脂肪酸類、萜類、生物堿、生氰糖苷等眾多植物次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶[13]。研究表明，成熟的酸漿屬果實(shí)和宿顎富含各類活性物質(zhì)，是提取分離酸漿苦味素類活性物質(zhì)的重要部位[14-15]。聚類分析結(jié)果表明，795個(gè)P450家族基因聚類于不同的組織特異表達(dá)cluster中。由于果實(shí)是苦蘵活性物質(zhì)的重要積累器官，篩選得到的果實(shí)特異表達(dá)P450家族基因成為后續(xù)重要的研究對(duì)象。

到目前為止，基因組和表達(dá)序列標(biāo)簽測(cè)序項(xiàng)目共發(fā)現(xiàn)了上千個(gè)植物細(xì)胞色素P450序列。P450酶系構(gòu)成植物中最大的超家族，并且這個(gè)超家族還在不斷擴(kuò)大[8]。通過(guò)對(duì)795個(gè)可能為P450家族基因的轉(zhuǎn)錄本的篩選分析與blast比對(duì)，最終得到了30個(gè)與其他物種高度同源的苦蘵P450家族基因的全長(zhǎng)序列。通過(guò)同源進(jìn)化分析，將這30個(gè)苦蘵P450基因分到9個(gè)亞家族中。這些基礎(chǔ)信息說(shuō)明，苦蘵中存在了一個(gè)龐大的P450超家族，并與其他模式植物的P450具有較高的同源性[13，16]。

已有報(bào)道指出，P450家族基因參與對(duì)果實(shí)成熟過(guò)程的調(diào)控。甜櫻桃PacCYP707A2負(fù)調(diào)控果實(shí)成熟[17]。在桑樹中，MaCYP707A1、MaCYP707A2、MaCYP707A3和MaCYP707A4在果實(shí)成熟早期表達(dá)量較高，而在果實(shí)成熟晚期表達(dá)量較低[18]。研究發(fā)現(xiàn)，9個(gè)苦蘵P450家族基因的表達(dá)水平隨著果實(shí)發(fā)育成熟而上升，而另9個(gè)基因的表達(dá)下降。同時(shí)，大量苦蘵P450基因，如comp164210、comp131532等，對(duì)ACC和1-MCP表現(xiàn)出不同的響應(yīng)。qRT-PCR數(shù)據(jù)表明，這些苦蘵P450家族基因的表達(dá)水平與苦蘵果實(shí)成熟密切相關(guān)。苦蘵果實(shí)積累了大量次生代謝活性物質(zhì)，研究果實(shí)成熟相關(guān)P450基因，為揭示苦蘵活性物質(zhì)的生物合成提供了基礎(chǔ)[14-15]。

3個(gè)果實(shí)特異表達(dá)的苦蘵P450基因中，comp164210基因?qū)儆诳嗵uP450家族中subfamily78，comp131532基因?qū)儆诳嗵uP450家族中subfamily81，comp152181基因?qū)儆诳嗵uP450家族中subfamily89。在模式植物中，subfamily78的P450基因參與控制頂端分生組織，并在其中發(fā)揮著重要作用[19]，推測(cè)本研究克隆的comp164210基因也可能在控制苦蘵頂端分生組織的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。subfamily81和subfamily89的基因往往編碼一個(gè)單(加)氧酶，參與植物次生代謝的各主要過(guò)程[20]。作為subfamily81和subfamily89的成員，comp131532和comp152181基因可能參與苦蘵活性物質(zhì)的次生代謝調(diào)控。

參與植物次生代謝的P450酶通常定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜上。如家蠶細(xì)胞色素P450蛋白CYP6AE21定位于細(xì)胞質(zhì)中[21]，擬南芥AtCYP1蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核中[22]，這與苦蘵comp164210和comp152181基因編碼蛋白相一致。也有報(bào)導(dǎo)稱，擬南芥CYP83A1蛋白定位于細(xì)胞膜質(zhì)結(jié)構(gòu)上，并參與植物抵御白粉菌的免疫反應(yīng)[23]，這與苦蘵comp131532基因編碼蛋白相一致。亞細(xì)胞定位的多樣化，為進(jìn)一步揭示苦蘵P450基因功能提供了遺傳信息。