維生素C對β-伴大豆球蛋白誘導的仔豬腸上皮細胞炎性損傷的保護作用

夏江英，楊 菊，宋天浩，龐蓮鳳，葉 婷，任志華，鄧俊良

(四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130)

大豆是飼料中的主要優質植物蛋白來源之一，β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)，又稱7S，是大豆中的最強抗原蛋白，易引發幼齡動物產生過敏反應[1]。β-伴大豆球蛋白主要造成仔豬腸道屏障結構和功能受損，激活體內免疫反應，引起炎癥介質的大量產生和釋放，造成仔豬生長抑制和腹瀉[2-3]。腸道不僅是消化、吸收營養物質的重要場所，也是機體的重要免疫屏障，腸上皮細胞增殖、遷移、分化的動態平衡是腸屏障功能發揮的前提和基礎。IPEC-J2來源于仔豬空腸上皮，具有與體內活性相當的分化特征，適合用于體外模型[4]。Wu等[5]證實，β-伴大豆球蛋白會導致斷奶仔豬腸道過敏損傷，以及腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、5-羥色胺(5-HT)等炎癥因子的表達量增加。腸道損傷的最直接原因是炎性因子的釋放，抑制炎癥因子分泌可能成為仔豬早期斷奶過敏的防治靶點。因此，修復腸道損傷是緩解β-伴大豆球蛋白致敏損傷的有效途徑。維生素C(vitamin C，VC)作為一種不可或缺的微量營養元素，具有獨特且復雜的生理功能，對維持腸道結構和功能的完整性具有重要作用[6-7]。有研究表明，VC能發揮抗炎、抗過敏等功能，其可通過調節相關細胞因子基因表達水平來緩解或消除過敏性炎性損傷[8-10]。因此，以IPEC-J2為研究對象，研究VC對IPEC-J2活力、膜完整性和炎性因子分泌的影響，旨在闡述VC抗炎作用的可能機制，為其充分開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

β-伴大豆球蛋白(7S)由中國農業大學食品工程學院提供；IPEC-J2由四川農業大學動物醫學院提供。VC，美國Sigma-Aldrich公司；胎牛血清和DMEM/F12培養基，美國Gibco Life Technologies公司；細胞增殖毒性CCK-8檢測試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)、二胺氧化酶(DAO)、腸型脂肪酸結合蛋白1(IFABP1)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)ELISA試劑盒，江蘇酶免實業有限公司；TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR和TransStart?Top Green qPCR SuperMix，北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司。

1.2 儀器

二氧化碳培養箱、全波長酶標儀、超微量生物檢測儀和臺式高速離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；PCR儀、凝膠成像分析系統和CFX96熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad Laboratories公司；倒置顯微鏡，日本Olympus Corporation公司；超凈工作臺(CJ-2F)，蘇州凈化設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 VC無毒劑量濃度篩選

取對數生長期IPEC-J2，計數后以每孔5 000個的密度接種于96孔板，每孔100 μL，過夜培養后更換培養液，分別添加6.25～2 000 μmol·L-1VC溶液處理每組細胞，以不添加VC的作為空白對照，每組4個重復。培養24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃避光孵育4 h后，用酶標儀測量各孔在450 nm處的吸光度(D450)。細胞存活率(%)=(實驗組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)×100。按照上述方法篩選出VC的無毒劑量濃度。

1.3.2 試驗分組與細胞存活率測定

參考文獻[11]的方法，收集對數生長期IPEC-J2，計數后以每孔5 000個的密度接種于96孔板。細胞分為10組：A(對照組)、B(5 mg·mL-17S模型組)、C(5 mg·mL-17S+25 μmol·L-1VC組)、D(5 mg·mL-17S+50 μmol·L-1VC組)、E(5 mg·mL-17S+100 μmol·L-1VC組)、F(5 mg·mL-17S+200 μmol·L-1VC組)、G(5 mg·mL-17S+400 μmol·L-1VC組)、H(5 mg·mL-17S+600 μmol·L-1VC組)、I(5 mg·mL-17S+800 μmol·L-1VC組)、J(5mg·mL-17S+1 000 μmol·L-1VC組)。其中，對照組不作任何干預，常規培養；7S模型組，加入5 mg·mL-17S培養24 h以復制細胞損傷模型；VC不同濃度保護組，各組細胞分別在加入25、50、100、200、400、600、800、1 000 μmol·L-1VC與5 mg·mL-17S的培養基中共同培養24 h，用CCK-8試劑盒檢測各組細胞存活率。

1.3.3 細胞形態學觀察

取對數生長狀態良好的IPEC-J2，細胞計數后以每孔1×106的密度接種于6孔板，每孔1 mL。細胞干預同1.3.2節，細胞干預后，用倒置顯微鏡進行各組細胞形態學觀察。

1.3.4 細胞膜完整性測定

將對數生長期IPEC-J2接種于6孔板中(每孔1×106個)，置于37 ℃、體積分數為5% CO2的培養箱中培養，細胞準備、分組與干預同1.3.2節。細胞干預完畢后，收集細胞上清液，依據ELISA試劑盒說明書檢測細胞上清液LDH、ALP、DAO、IFABP1含量。

1.3.5 細胞上清液細胞因子含量的測定

將IPEC-J2懸液接種于6孔板(每孔1×106個)，每孔1 mL，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。細胞貼壁后，吸棄上清，細胞準備、分組與干預同1.3.2節。細胞培養24 h后，收集上清液，用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10含量，具體方法按試劑盒說明進行。

1.3.6 細胞內細胞因子mRNA表達測定

取對數生長的IPEC-J2，接種6孔板(每孔1×106個)，每孔1 mL，待細胞貼壁后，按照1.3.2節的分組和處理方法培養24 h后，收集細胞至1.5 mL離心管中，采用Trizol法常規提取IPEC-J2總RNA，逆轉錄為cDNA后用real-time PCR儀擴增，以2-△△CT法計算各組細胞因子mRNA的相對表達量。β-actin、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因real-time PCR引物序列

1.4 數據處理

試驗數據使用SPSS 22.0統計分析軟件進行單因素分析(one-way ANOVA)后，用平均值±標準差表示，P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 VC對正常培養IPEC-J2存活率的影響

由圖1-a可知，單獨添加6.25、12.5、800、1 000 μmol·L-1VC對IPEC-J2沒有明顯的增殖或毒性抑制作用，細胞活力正常，與對照組相比無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，單獨添加25～600 μmol·L-1的VC使細胞存活率顯著升高(P<0.05或P<0.01)，當VC濃度高于1 000 μmol·L-1時，可顯著抑制細胞生長，與對照組相比有極顯著差異(P<0.01)。因此，VC濃度為25～1 000 μmol·L-1時對細胞無明顯毒性，是安全劑量，可作為下一步試驗的溶液濃度。

a，VC對IPEC-J2存活率的影響。b，VC對7S誘導下IPEC-J2存活率的影響。A，對照組；B，7S模型組；C，7S+25 μmol·L-1 VC組；D，7S+50 μmol·L-1 VC組；E，7S+100 μmol·L-1 VC組；F，7S+200 μmol·L-1 VC組；G，7S+400 μmol·L-1 VC組；H，7S+600 μmol·L-1 VC組；I，7S+800 μmol·L-1 VC組；J，7S+1 000 μmol·L-1 VC組。*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，#表示與7S模型組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與7S模型組相比差異極顯著(P<0.01)。下同。a， Effect of VC on survival rate of IPEC-J2.b， Effect of VC on survival rate of IPEC-J2 induced by 7S.A， Control group; B， 7S model group; C， 7S+25 μmol·L-1 VC group; D， 7S+50 μmol·L-1 VC group; E， 7S+100 μmol·L-1 VC group; F， 7S+200 μmol·L-1 VC group; G， 7S+400 μmol·L-1 VC group; H， 7S+600 μmol·L-1 VC group; I， 7S+800 μmol·L-1 VC group; J， 7S+1 000 μmol·L-1 VC group. * and **showed significant difference compared with the control group at P<0.05 and P<0.01， # and ## showed significant difference compared with 7S model group at P<0.05 and P<0.01. The same as below.圖1 VC和7S對IPEC-J2存活率的影響Fig.1 Effect of VC and 7S on survival rate of IPEC-J2

2.2 VC對7S誘導下IPEC-J2存活率的影響

由圖1-b可知，與對照組相比，7S模型組細胞存活率顯著降低(P<0.01)，表明7S可引起細胞毒性。與7S模型組相比，同時添加25、50、100、200、400、600、800、1 000 μmol·L-1VC組的細胞存活率均有不同程度升高(P<0.01)，且VC濃度為100 μmol·L-1時，細胞存活率最高，說明其抗7S損傷作用最強。

2.3 VC對7S誘導下IPEC-J2形態的影響

如圖2所示，顯微鏡下觀察發現正常組細胞呈不規則多邊形，輪廓清晰，大小均勻，鋪路石樣生長。5 mg·mL-17S刺激后，細胞皺縮變圓，細胞間隙增寬，少數細胞懸浮脫落，細胞碎片較多。25～600 μmol·L-1VC與7S同時添加組的細胞形態均有不同程度改善，細胞皺縮明顯減少，細胞間隙變小，且VC濃度在100 μmol·L-1時，其作用效果愈加明顯。但800 μmol·L-1和1 000 μmol·L-1VC與7S同時添加組的細胞大量懸浮脫落，細胞形態異常。

圖2 VC對7S刺激IPEC-J2后細胞形態的影響(×100)Fig.2 Effect of VC on morphology of IPEC-J2 stimulated by 7S (×100)

2.4 VC對7S誘導下IPEC-J2細胞膜完整性的影響

如圖3所示，與對照組相比，7S模型組IPEC-J2上清液中的LDH、ALP、DAO、IFABP1含量顯著升高(P<0.01)。與7S模型組比較，25～1 000 μmol·L-1VC與7S同時添加對IPEC-J2上清液中的LDH、ALP、DAO、IFABP1含量均具有抑制作用(P<0.01)，且當VC濃度在100 μmol·L-1時，LDH、ALP、DAO、IFABP1含量低于其他各組。

圖3 VC對7S誘導下IPEC-J2細胞膜完整性的影響Fig.3 Effect of VC on membrane integrity of IPEC-J2 induced by 7S

2.5 VC對7S誘導的IPEC-J2促炎因子分泌的影響

如圖4所示，與對照組相比，7S模型組IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著增加(P<0.01)，分別由25.91、256.68、226.96 ng·L-1上升至45.49、429.66、279.09 ng·L-1。與7S模型組相比，各濃度的VC與7S共同添加組均能降低細胞促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量(P<0.05或P<0.01)，且下降幅度隨VC濃度的升高呈先降低后升高的趨勢。上述結果表明，VC可以顯著降低IPEC-J2促炎因子釋放水平。

圖4 VC對7S誘導下IPEC-J2上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平的影響Fig.4 Effects of VC on secretion levels of IL-1β， IL-6 and TNF-α in supernatant ofIPEC-J2 induced by 7S

2.6 VC對7S誘導的IPEC-J2抗炎因子分泌的影響

如圖5所示，與對照組相比，7S刺激后的IPEC-J2中IL-4和IL-10分泌水平顯著降低，分別降低了62.58%(P<0.01)和38.35%(P<0.01)；相較于7S組，同時添加7S和25～1 000 μmol·L-1VC組的細胞上清液中IL-4和IL-10含量明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖5 VC對7S誘導下IPEC-J2上清液中IL-4和IL-10分泌水平的影響Fig.5 Effects of VC on IL-4 and IL-10 secretion levels in supernatants ofIPEC-J2 induced by 7S

2.7 VC對7S誘導的IPEC-J2促炎因子mRNA表達水平的影響

采用qRT-PCR方法分別檢測促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平。由圖6可知，與對照組相比，7S刺激后IPEC-J2中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平顯著升高，分別升高了4.10倍、4.38倍和5.02倍(P<0.01)；給予VC干預后，25～1 000 μmol·L-1各劑量組均能降低7S誘導的IPEC-J2中IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平，mRNA的表達變化與ELISA檢測結果相一致。

2.8 VC對7S誘導的IPEC-J2抗炎因子的mRNA表達水平的影響

如圖7所示，與對照組相比，7S處理組IL-4和IL-10的mRNA水平顯著降低，分別降低了48.75%和51.09%(P<0.01)；相較于7S組，25～1 000 μmol·L-1VC與7S共同添加組IL-4和IL-10基因表達均上調，差異具有統計學意義(P<0.01)。從mRNA表達水平來看，VC具有明確的抗炎癥反應作用。

3 討論

3.1 VC對7S誘導的IPEC-J2細胞活力的影響

張瑜[12]和Chen等[13]研究結果表明，7S可極顯著抑制豬腸上皮細胞的增殖，且5 mg·mL-17S可對腸上皮細胞造成嚴重損傷，細胞表現為腸上皮細胞總數量減少，不規則形狀和輪廓不清晰的細胞明顯增多，細胞脫落程度加大，破壞腸上皮細胞結構。故本試驗選取5 mg·mL-17S作用24 h復制仔豬腸上皮細胞損傷模型。

有研究報道，VC對緩解過敏反應有保護作用，可減輕腸道炎癥損傷[14]。本實驗結果表明，VC對7S導致的細胞存活率下降有拮抗作用，且濃度為100 μmol·L-1的VC作用最佳，這與Yin等[15]的研究結果一致。但本研究中IPEC-J2存活率隨著VC濃度的增大先升高后下降，在一定濃度范圍內IPEC-J2活力與VC濃度呈正相關，但超過一定濃度反而下降。有研究發現，過量的VC會轉化成活性氧，對細胞造成氧化損傷作用，影響細胞的增殖活性[16]，這一觀點可以解釋上述結果。

細胞形態學變化結果呈現同樣趨勢。7S可造成IPEC-J2形態改變，細胞間隙增寬，細胞碎片增多，影響腸細胞的完整性。加入不同濃度的VC(25～600 μmol·L-1)與7S共同培養后，與7S組相比，細胞形態均有不同程度的改善，細胞數量明顯增多，且VC濃度在100 μmol·L-1時，其作用效果愈加明顯，細胞形態恢復正常狀態，幾乎沒有碎片；但高濃度VC可加劇細胞損傷，細胞大量懸浮脫落，這與王亞萍等[17]的研究結果一致。表明適量VC可提高7S損傷的IPEC-J2活力，并對IPEC-J2細胞形態具有保護作用。

3.2 VC對7S誘導的IPEC-J2細胞膜完整性的影響

LDH、ALP、DAO、IFABP1是腸道黏膜上皮細胞中的細胞內酶或蛋白，當腸道黏膜上皮損傷時可迅速釋放到胞外，細胞上清液LDH、ALP、DAO、IFABP1含量升高可作為衡量腸道黏膜上皮細胞損傷程度的重要指標[18-20]。曹程鳴等[21]研究表明，β-伴大豆球蛋白使斷奶仔豬血漿DAO含量增加，腸道完整性遭到破壞。本試驗研究發現，當7S為5 mg·mL-1時，7S模型組的IPEC-J2活力下降，細胞膜遭到破壞，豬小腸上皮細胞上清液中的LDH、ALP、DAO、IFABP1含量極顯著增加，這進一步證實了曹程鳴等[21]的研究結果。劉揚等[22]研究報道，VC可促進體外培養建鯉腸上皮細胞的增殖和分化成熟，維持腸上皮細胞膜完整性，細胞培養液中LDH、ALP含量顯著降低。本試驗用不同濃度VC與7S共同干預細胞后，豬小腸上皮細胞上清液中的LDH、ALP、DAO、IFABP1含量降低，說明VC可以降低7S對細胞膜的損傷，從而對損傷的上皮細胞起到保護作用。

3.3 VC對7S誘導的IPEC-J2炎性因子的影響

炎癥反應在胃腸損傷機制中具有重要作用，體現了動物機體內部組織促炎性因子和抗炎性因子兩者作用的結果。IL-1β、IL-6、TNF-α是主要的促炎因子，IL-4、IL-10是主要的抗炎因子，其動態變化決定炎癥發展方向[23]。7S是公認的致敏源，常常誘導幼齡動物發生過敏反應，7S誘導后能夠分泌多種促炎性細胞因子(IL-6、NO、5-HT、DAO)，抑制抗炎因子IL-10的分泌[24-26]。本研究表明，單獨使用7S可顯著上調IPEC-J2致炎因子基因(IL-1、IL-6、TNF-α)的表達，顯著下調抗炎因子基因(IL-4、IL-10)的表達，表明7S誘導細胞炎性反應，這與Wu等[5]研究結果相一致。

VC具有抗炎作用，可降低促炎因子TNF-α和IL-6的產生，增加抗炎因子IL-10的產生[27-28]。Chen等[29]研究顯示，VC能顯著抑制巨噬細胞分泌TNF-α和IL-6，以抑制炎癥反應的產生。本試驗結果表明，經過VC處理后，細胞促炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達顯著下調，抗炎性細胞因子IL-4、IL-10的基因表達水平上調，這與Suluvoy等[30]研究結果類似。Yan等[31]在對小鼠結腸炎的研究中發現，VC能有效緩解由葡聚糖硫酸鈉(DSS)引起的損傷作用，顯著抑制NF-κB途徑的活化從而抑制細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17的生成，提高細胞抗炎能力。因此，說明VC可以調節IPEC-J2細胞因子的表達，減緩腸道炎癥反應，從而參與保護7S誘導的炎癥反應。

4 結論

本研究表明，7S能降低仔豬腸上皮細胞活性，破壞小腸上皮細胞完整性，誘導仔豬腸上皮細胞炎性損傷，并通過上調細胞促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、下調抗炎因子(IL-4、IL-10)的分泌刺激炎癥發展，發生過敏反應。而VC具有抗炎作用，能抑制7S造成的炎性損傷，且濃度為100 μmol·L-1的VC抑制炎癥效果較好。證明VC對炎性損傷具有一定的修復和保護作用，為進一步改善因7S引起的仔豬腹瀉現狀提供理論依據。