維生素A對(duì)大豆7S球蛋白致仔豬腸上皮細(xì)胞屏障功能損傷的影響

楊 菊， 鄧俊良， 夏江英， 宋天浩， 龐蓮鳳， 任志華

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

仔豬早期斷奶是提高母豬繁殖效益的重要技術(shù)手段，但斷奶后腹瀉導(dǎo)致的仔豬體重流失、生長性能降低給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。有研究指出，大豆抗原蛋白導(dǎo)致的斷奶仔豬腸道損傷是仔豬斷奶后腹瀉的根本原因[1-2]，大豆抗原蛋白的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)且具有一定的抗消化性[3]，難以通過膨化、酶解等方式被完全去除[4]。大豆7S球蛋白約占大豆總可溶性蛋白的1/3，其主要由β-伴大豆球蛋白、γ-伴大豆球蛋白和堿性7S球蛋白組成，是大豆中的主要抗原蛋白，會(huì)引起斷奶仔豬等幼齡動(dòng)物免疫功能紊亂和腸道損傷[5-6]，進(jìn)而影響其生長性能。大豆7S球蛋白引起的腸道損傷主要表現(xiàn)為腸黏膜形態(tài)損傷和屏障功能損傷，且大豆7S球蛋白與斷奶仔豬空腸中后段的結(jié)合能力最強(qiáng)[7]。本研究的對(duì)象IPEC-J2是首次于1989年從新生仔豬空腸中段分離出的非轉(zhuǎn)化柱狀上皮細(xì)胞系[8]，是用于體外研究豬腸道相關(guān)性疾病/營養(yǎng)代謝的主要對(duì)象。

維生素A(vitamin A，VA)是動(dòng)物機(jī)體所必需的脂溶性維生素，對(duì)多種上皮細(xì)胞的生長分化具有調(diào)節(jié)作用；同時(shí)，還能發(fā)揮抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，是維持黏膜上皮屏障完整性的重要因子[9]。機(jī)體(尤其是兒童)VA狀態(tài)與腹瀉類疾病的發(fā)生有密切關(guān)系，補(bǔ)充一定劑量的VA對(duì)腹瀉類疾病具有預(yù)防和輔助治療的效果[10]。研究已證實(shí)，VA對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[11]。

本研究以IPEC-J2為研究對(duì)象，以大豆7S球蛋白作為誘導(dǎo)因素，從細(xì)胞活力、細(xì)胞跨膜電阻(trans-epithelial electrical resistance，TEER)、熒光素鈉滲透性、細(xì)胞膜完整性與緊密連接蛋白基因表達(dá)幾個(gè)方面探究VA對(duì)大豆7S球蛋白致IPEC-J2細(xì)胞屏障功能損傷的影響，為VA能否用于防治斷奶仔豬蛋白營養(yǎng)性腹瀉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆7S球蛋白由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院郭順堂教授提供(專利號(hào)：CN200410029589.4，純度為86.9%)；IPEC-J2由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院徐志文教授惠贈(zèng)；VA、熒光素鈉購自美國Sigma-Aldrich公司；DMEM F/12培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；澳洲胎牛血清、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、二胺氧化酶(DAO)、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白1(IFABP1)的ELISA檢測(cè)試劑盒購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；CCK-8試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；24孔Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；細(xì)胞跨膜電阻儀購自美國Merck Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)共分為9組：對(duì)照組(control)、7S(5 mg·mL-17S)、7S+A1(5 mg·mL-17S+0.01 μmol·L-1VA)、7S+A2(5 mg·mL-17S+0.1 μmol·L-1VA)、7S+A3(5 mg·mL-17S+1 μmol·L-1VA)、7S+A4(5 mg·mL-17S+ 10 μmol·L-1VA)、7S+A5(5 mg·mL-17S+100 μmol·L-1VA)、7S+A6(5 mg·mL-17S+1 000 μmol·L-1VA)、7S+A7(5 mg·mL-17S+10 000 μmol·L-1VA)。除檢測(cè)細(xì)胞活力每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)外，其余指標(biāo)每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

將對(duì)數(shù)生長期的IPEC-J2以每孔5×103個(gè)的密度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后按分組分別加入對(duì)應(yīng)濃度的處理物，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，向每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下讀取吸光度(D值)。

1.2.3 細(xì)胞跨膜電阻檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長期的IPEC-J2以每孔2×104個(gè)的密度接種于24孔Transwell培養(yǎng)板(直徑6.5 mm，孔徑0.4 μm，面積0.33 cm2)上層，第1星期隔天換液，之后每天換液，并于換液之前檢測(cè)TEER，直至TEER穩(wěn)定，說明IPEC-J2融合至單層。阻值穩(wěn)定后，按分組分別加入相應(yīng)濃度的處理物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行TEER測(cè)定。TEER=(實(shí)測(cè)值-空白值)×有效膜面積。

1.2.4 熒光素鈉滲透率檢測(cè)

在1.2.3節(jié)測(cè)完TEER之后，吸去培養(yǎng)液，使用37 ℃預(yù)熱的D-Hanks緩沖液清洗細(xì)胞3次，向Transwell上層加入200 μL含60 μg·L-1熒光素鈉的D-Hanks溶液，下層加入700 μL D-Hanks溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育1 h，吸取下層溶液檢測(cè)490 nm波長下的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算熒光素鈉濃度，再計(jì)算熒光素鈉滲透率。熒光素鈉滲透率(%)=(下層熒光素鈉濃度×700)/(60×200)×100。

1.2.5 細(xì)胞膜完整性相關(guān)指標(biāo)含量檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長期的IPEC-J2以每孔1×105個(gè)的密度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后按分組分別加入對(duì)應(yīng)濃度的處理物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集上層細(xì)胞培養(yǎng)液離心去沉淀，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)ALP、LDH、DAO、IFABP1的含量。

1.2.6熒光定量PCR檢測(cè)ZO-1、Claudin-1和Occludin基因表達(dá)情況

將1.2.5節(jié)的下層細(xì)胞按照Trizol法進(jìn)行RNA提取，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以5倍稀釋的cDNA為模板，檢測(cè)ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表達(dá)量，引物序列見表1。結(jié)果按2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

表1 熒光定量PCR引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，柱狀圖繪制軟件為GraphPad. Prism 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆7S球蛋白誘導(dǎo)下VA對(duì)IPEC-J2活力的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，5 mg·mL-1的7S球蛋白導(dǎo)致IPEC-J2活力極顯著降低(P<0.01)。與單獨(dú)添加7S球蛋白組相比，0.1和1 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組細(xì)胞活力極顯著(P<0.01)升高，10 000 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組的IPEC-J2活力極顯著降低(P<0.01)。

柱形圖中無相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Data on the bars marked without the same uppercase letter indicated significant differences at P<0.01， data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.圖1 大豆7S球蛋白誘導(dǎo)下VA對(duì)IPEC-J2活力的影響Fig.1 Effect of VA on viability of IPEC-J2 injured by soybean 7S globulin

2.2 大豆7S球蛋白誘導(dǎo)下VA對(duì)IPEC-J2單層細(xì)胞TEER的影響

如圖2所示，隨著IPEC-J2在Transwell培養(yǎng)板里培養(yǎng)時(shí)間的延長，TEER呈逐漸升高的趨勢(shì)，在第18天后穩(wěn)定在500 Ω·cm-2以上，說明IPEC-J2融合成單層。

圖2 IPEC-J2的細(xì)胞跨膜電阻Fig.2 Trans-epithelial electrical resistance of IPEC-J2

如圖3所示，與對(duì)照組相比，5 mg·mL-17S球蛋白處理使IPEC-J2單層細(xì)胞的TEER極顯著(P<0.01)降低。0.1～10 μmol·L-1的VA與7S同時(shí)添加組的TEER顯著(P<0.01)高于7S單獨(dú)處理組，但10 000 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組的TEER極顯著(P<0.01)降低。

圖3 大豆7S球蛋白誘導(dǎo)下VA對(duì)IPEC-J2單層細(xì)胞細(xì)胞跨膜電阻的作用Fig.3 Effect of VA on trans-epithelial electrical resistance of IPEC-J2 monolayer cells induced by soybean 7S globulin

2.3 大豆7S球蛋白誘導(dǎo)下VA對(duì)IPEC-J2單層細(xì)胞通透性的影響

對(duì)熒光素鈉滲透率的影響結(jié)果如圖4，與對(duì)照組相比，添加5 mg·mL-17S球蛋白導(dǎo)致IPEC-J2單層細(xì)胞對(duì)熒光素鈉的滲透率極顯著(P<0.01)升高。0.01～10 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組的熒光素鈉滲透率極顯著(P<0.01)低于7S單獨(dú)處理組；1 000和10 000 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組熒光素鈉滲透率極顯著(P<0.01)高于7S單獨(dú)處理組。

圖4 大豆7S球蛋白誘導(dǎo)下VA對(duì)IPEC-J2單層細(xì)胞熒光素鈉滲透率的影響Fig.4 Effect of VA on permeability of sodium fluorescein of IPEC-J2 monolayer cells induced by soybean 7S globulin

2.4 大豆7S球蛋白誘導(dǎo)下VA對(duì)IPEC-J2細(xì)胞膜完整性的影響

VA對(duì)大豆7S球蛋白破壞IPEC-J2細(xì)胞膜完整性相關(guān)指標(biāo)的影響見圖5。單獨(dú)添加5 mg·mL-17S球蛋白導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP、LDH、DAO和IFABP1含量極顯著(P<0.01)升高。0.01 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組的ALP、LDH和DAO含量與7S單獨(dú)處理組差異不顯著，0.1～10 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組的ALP、LDH和DAO含量均顯著(P<0.05或0.01)低于7S單獨(dú)處理組；0.01～10 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組的IFABP1含量均顯著(P<0.05或0.01)低于7S單獨(dú)處理組；而10 000 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組的ALP、LDH、DAO和IFABP1含量則顯著(P<0.05或0.01)高于7S單獨(dú)處理組。

圖5 大豆7S球蛋白誘導(dǎo)下VA對(duì)IPEC-J2細(xì)胞膜完整性的影響Fig.5 Effect of VA on destruction of IPEC-J2 integrity by soybean 7S globulin

2.5 大豆7S球蛋白誘導(dǎo)下VA對(duì)IPEC-J2緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響

如圖6所示，單獨(dú)添加5 mg·mL-17S球蛋白導(dǎo)致IPEC-J2緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著(P<0.01)降低。由圖6-a可知，0.1～10 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組的ZO-1 mRNA表達(dá)量極顯著高于7S單獨(dú)處理組(P<0.01)，而10 000 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組導(dǎo)致ZO-1 mRNA表達(dá)量極顯著(P<0.01)低于7S單獨(dú)處理組。由圖6-b可知，0.1和1 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組的Claudin-1 mRNA表達(dá)量顯著(P<0.05)高于7S單獨(dú)處理組。由圖6-c可知，0.1～10 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加組的OccludinmRNA表達(dá)量顯著(P<0.05或0.01)高于7S單獨(dú)處理組。

圖6 大豆7S球蛋白誘導(dǎo)下VA對(duì)IPEC-J2緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of VA on expression of tight junction protein genes in IPEC-J2 induced by soybean 7S globulin

3 討論

3.1 大豆7S球蛋白對(duì)IPEC-J2細(xì)胞屏障功能的損傷作用

作為大豆中的主要致敏蛋白，大豆7S球蛋白主要危害斷奶仔豬的腸道健康進(jìn)而影響其生長性能。體外試驗(yàn)表明，大豆7S球蛋白主要抑制仔豬腸上皮細(xì)胞的體外增殖、誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡和自噬進(jìn)而導(dǎo)致其活性下降，還會(huì)破壞腸上皮細(xì)胞的完整性，抑制緊密連接蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致體外腸上皮細(xì)胞模型的通透性升高，且7S球蛋白濃度越高，作用時(shí)間越長，影響越顯著[12-15]。本試驗(yàn)參考彭成璐等[16]的研究，用5 mg·mL-17S球蛋白作為誘導(dǎo)因素處理IPEC-J2 24 h，進(jìn)行細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建。試驗(yàn)結(jié)果表明，5 mg·mL-1的7S球蛋白處理24 h使IPEC-J2的細(xì)胞活力極顯著降低，與前人研究結(jié)果一致。

腸黏膜機(jī)械屏障主要由腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞間的連接復(fù)合物組成，因此，腸上皮細(xì)胞的完整性和細(xì)胞間連接的狀態(tài)是影響腸黏膜機(jī)械屏障通透性的主要因素。TEER是用于評(píng)價(jià)上皮屏障通透性和完整性的重要指標(biāo)，其值越大說明屏障通透性越低。LDH是細(xì)胞內(nèi)酶，ALP是細(xì)胞膜的標(biāo)志性酶，當(dāng)細(xì)胞受到損傷、細(xì)胞膜完整性被破壞時(shí)會(huì)釋放，因此，細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH和ALP含量(或活性)是普遍用來評(píng)價(jià)細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)[17]。而DAO和IFABP1是腸上皮細(xì)胞的胞內(nèi)蛋白，具有很高的組織特異性，只有當(dāng)腸上皮細(xì)胞受損時(shí)才會(huì)釋放到細(xì)胞外，其在血液中的含量是臨床上用來監(jiān)測(cè)腸黏膜屏障通透性的特異性指標(biāo)[18]。因此，腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALP、LDH、DAO和IFABP1含量能間接反映細(xì)胞膜的完整性。緊密連接復(fù)合物是維持腸黏膜機(jī)械屏障的重要結(jié)構(gòu)，其中，Claudins是腸黏膜上皮選擇性屏障的主要結(jié)構(gòu)蛋白；Occludin是維持腸黏膜上皮細(xì)胞間通透性的主要功能蛋白；ZOs與細(xì)胞骨架蛋白形成廣泛連接，在細(xì)胞間連接的形成、結(jié)構(gòu)和功能變化中起重要的作用[19]。賈剛等[12]研究表明，7S球蛋白導(dǎo)致仔豬腸上皮細(xì)胞IECs完整性破壞，LDH和ALP的釋放增加。Zhao等[13]研究表明，7S球蛋白導(dǎo)致IPEC-J2的ALP釋放增加，Occludin和ZO-1的mRNA表達(dá)量降低，TEER降低。Peng等[15]也發(fā)現(xiàn)，7S球蛋白能通過下調(diào)Occludin、ZO-1和Claudin-1的表達(dá)破壞IPEC-J2的細(xì)胞骨架。以上研究表明，7S球蛋白會(huì)通過破壞腸上皮細(xì)胞的完整性，以及抑制緊密連接蛋白的表達(dá)導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞屏障通透性升高；本研究中5 mg·mL-17S球蛋白導(dǎo)致IPEC-J2單層細(xì)胞TEER極顯著降低，熒光素鈉滲透率極顯著升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP、LDH、DAO和IFABP1含量極顯著升高，ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表達(dá)量極顯著下調(diào)，與前人研究結(jié)果相符。

3.2 VA對(duì)大豆7S球蛋白致IPEC-J2細(xì)胞屏障功能損傷的作用

VA是動(dòng)物必需的脂溶性維生素，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等生物功能。給正常動(dòng)物機(jī)體添加一定水平的VA能夠促進(jìn)腸道發(fā)育，使腸隱窩變淺、絨毛增高，但過高水平的VA反而會(huì)抑制腸道發(fā)育[20]。添加VA會(huì)導(dǎo)致體外培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞增殖數(shù)量減少[21]，但促進(jìn)了腸上皮細(xì)胞的分化[22]。以上研究表明，VA通過抑制腸上皮細(xì)胞增殖、增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞分化來促進(jìn)腸道生長發(fā)育。但當(dāng)腸道受到損傷時(shí)，補(bǔ)充VA能在短時(shí)間內(nèi)極顯著促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞的增殖[23]。關(guān)于VA對(duì)體外腸上皮細(xì)胞活力損傷發(fā)揮保護(hù)作用的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，0.01～10 μmol·L-1VA能緩解7S對(duì)IPEC-J2活力的損傷，且0.1和1 μmol·L-1VA效果較好。p38/JNK MAKP信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是7S球蛋白損傷IPEC-J2活力的主要因素[16]，VA能通過降低JNK磷酸化水平對(duì)糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用[24]，因此，推測(cè)VA也可能通過影響JNK MAKP信號(hào)通路對(duì)7S損傷IPEC-J2活力發(fā)揮保護(hù)作用。且本研究發(fā)現(xiàn)，10 000 μmol·L-1VA導(dǎo)致IPEC-J2活力進(jìn)一步降低，說明添加高濃度VA反而會(huì)損傷腸上皮細(xì)胞。

VA能通過促進(jìn)腸細(xì)胞增殖、抑制凋亡來維持腸黏膜的屏障功能[25]。體內(nèi)試驗(yàn)證明，給乳糖誘導(dǎo)的腹瀉大鼠補(bǔ)充VA，能顯著降低血清中DAO和Zonulin蛋白的含量，且顯著上調(diào)小腸Claudin-1和Occludin的表達(dá)[26]，提前補(bǔ)充VA也能緩解LPS導(dǎo)致的小鼠腸道ZO-1、Occludin和Claudin-1表達(dá)降低的情況[27]。Baltes等[22]發(fā)現(xiàn)，在無血清培養(yǎng)液中添加VA能通過促進(jìn)Claudin-2的表達(dá)，增強(qiáng)Caco2單層細(xì)胞屏障的完整性，導(dǎo)致其對(duì)甘露醇的通透性降低，TEER升高。Yamada等[28]研究發(fā)現(xiàn)，添加VA能促進(jìn)ZO-1的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞衍生的腸道類器官的屏障功能。He等[11]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充VA能夠緩解LPS下調(diào)IPEC-J2的ZO-1、Occludin、Claudin-1表達(dá)的作用，從而保護(hù)IPEC-J2單層細(xì)胞的屏障功能。以上研究表明，補(bǔ)充VA能通過影響緊密連接蛋白的表達(dá)對(duì)腸上皮細(xì)胞的屏障功能發(fā)揮增強(qiáng)和保護(hù)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，0.1～10 μmol·L-1VA與7S同時(shí)添加極顯著緩解了7S導(dǎo)致的IPEC-J2單層細(xì)胞TEER降低、熒光素鈉通透性升高的情況，也極顯著降低了細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP、LDH、DAO和IFABP1的含量，0.1和1 μmol·L-1VA同時(shí)顯著緩解了7S導(dǎo)致的IPEC-J2中ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表達(dá)下調(diào)。說明一定劑量的VA能影響IPEC-J2完整性和緊密連接蛋白的mRNA表達(dá)，從而緩解7S導(dǎo)致的IPEC-J2單層細(xì)胞通透性損傷。Jiang等[29]發(fā)現(xiàn)，VA缺乏會(huì)上調(diào)MLCK的表達(dá)，進(jìn)而抑制魚腸道黏膜中緊密連接復(fù)合物的表達(dá)，說明VA影響緊密連接蛋白表達(dá)的機(jī)制可能與MLCK信號(hào)通路有關(guān)，但還需進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)10 000 μmol·L-1VA會(huì)加重7S球蛋白對(duì)IPEC-J2單層細(xì)胞通透性的損傷，這可能是由于過量VA導(dǎo)致了脂質(zhì)過氧化[30]，進(jìn)而損傷了IPEC-J2的細(xì)胞活力。

4 結(jié)論

IPEC-J2培養(yǎng)液中同時(shí)添加VA與大豆7S球蛋白，0.1～10 μmol·L-1VA能通過保護(hù)細(xì)胞活力和細(xì)胞完整性，影響緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表達(dá)對(duì)大豆7S球蛋白導(dǎo)致的IPEC-J2細(xì)胞屏障功能損傷發(fā)揮保護(hù)作用，10 000 μmol·L-1VA會(huì)加重這種損傷。