三角帆蚌細胞周期蛋白基因篩選及其表達分析

馮上樂，李雪男，陳一格，劉瑞琦，白志毅，b，c，李文娟，b，c，*

(上海海洋大學 a. 農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室；b. 水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室；c. 水產科學國家級實驗教學示范中心，上海201306)

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)隸屬于軟體動物門(Mollusca)雙殼綱(Bivalvia)真瓣鰓目(Eulamellibranchia)蚌科(Unionidae)帆蚌屬，主要分布于中國長江下游廣大流域，是中國特有的淡水育珠蚌，占據重要的經濟與戰略地位[1]。在三角帆蚌體外細胞培養研究中，游離細胞的增殖能力較低，活性較差[2-3]，限制了該領域細胞學方面的研究，至今細胞系的建立仍未突破。細胞周期蛋白在細胞周期過程中發揮重要作用，是細胞分裂的內在動力因子，參與細胞的增殖、分化[4]。因此，探究細胞周期蛋白在細胞分裂過程中的作用對解決游離細胞增殖問題具有重要意義。

1983年，在海膽(Echinoidea)中發現周期蛋白，隨后在高等真核生物中數十種周期蛋白被相繼發現，但在細胞周期時相轉換中，僅有A、B、C、D、E 5種周期蛋白發揮關鍵作用[5]。水生動物中，對細胞周期蛋白基因A、B、E的研究集中于性腺發育過程，很多研究表明，在性腺發育過程中，這3種周期蛋白基因均存在高表達，且cyclinA、cyclinB隨著性腺發育表達量逐漸升高[6-8]。細胞周期蛋白A參與調控細胞周期S期和M期，Visudtiphole等[9]從斑節對蝦(Penaeusmonodon)中克隆了cyclinA基因，并發現其在成體卵巢中表達水平顯著高于幼體。成熟促進因子(mature promoting factor，MPF)是動物卵母細胞和精母細胞減數分裂成熟過程中控制G2/M期轉變的關鍵調控因子，細胞周期蛋白B是MPF的主要成分，在海膽、斑節對蝦的卵母細胞，以及刀額新對蝦(Metapenaeusensis)、大黃魚(Larimichthyscrocea)卵巢中均大量表達，推測其與卵巢的發育密切相關[10-14]。細胞周期蛋白D(cyclin D)參與調控細胞周期G1期，在水生生物中研究較少，對海膽的研究認為cyclin D對其胚胎早期發育有重要作用[15]。細胞周期蛋白E能與周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)結合調節G1/S期的轉換，但其功能在水生動物中研究較少。Kurokawa等[16]克隆了海膽cyclinE基因的cDNA序列，發現海膽cyclin E氨基酸序列與爪蟾(Xenopuslaevis)、斑馬魚(Daniorerio)的cyclin E氨基酸序列高度相似。目前，cyclin基因在貝類中的研究較少。王桐等[17]在長牡蠣(Crassostreagigas)克隆得到cyclinB3基因，其表達量與性腺發育程度有關。劉佳敏等[18]克隆了三角帆蚌cyclinB基因，認為其在生殖細胞減數分裂中發揮重要作用，尚未見更深入的研究報道。

鑒于細胞周期蛋白在細胞增殖進程中的重要作用，使用Illumina HiSeq 2000對三角帆蚌進行轉錄組測序，參考實驗室構建的不同時間外套膜插核的數字基因表達譜(digital gene expression profiling，DGE)，進行三角帆蚌細胞周期蛋白基因篩選，結合生物信息分析和分子生物學手段，對靶基因進行初步驗證，構建了三角帆蚌不同性別與組織cyclins基因的表達譜，為以后的功能研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用三角帆蚌取自武義偉民水產養殖生產基地，挑選體重、體型相似，健康的2齡三角帆蚌，暫養于實驗室中，日常投喂小球藻并充氧。

轉錄組測序樣品選取：隨機選取10只三角帆蚌，取其血淋巴、外套膜、性腺與內臟團分別置于滅菌的1.5 mL離心管中，迅速放入液氮中速凍，-80 ℃保存。

熒光定量樣品選取：隨機挑選15只雌蚌和15只雄蚌(三角帆蚌雌雄鑒別參考吳從迪等[19]的方法)，分別取閉殼肌、內臟團、外套膜、斧足、心臟、血液、鰓與性腺，用0.5% DEPC(Invitrogen，美國)水洗凈，置于滅菌1.5 mL離心管中并放入液氮中速凍，-80 ℃保存。

1.2 轉錄組測序分析

1.2.1 RNA提取、cDNA文庫構建和Illumina測序、組裝

RNA提取方法參照Trizol?Reaget(Invitrogen，美國)的說明，RNA純度和濃度使用NANODROP 2000C(Thermo Fisher Scientific，美國)測定，RNA質量采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，cDNA文庫的構建和Illumina HiSeq 2000測序在北京諾禾致源科技股份有限公司進行，獲得的測序原始數據經過去除接頭、雜質和去冗余處理，并經Trinity軟件拼接和同源基因的聚類分析后，獲得unigene序列。

1.2.2 基因功能注釋與cyclins基因篩選

組裝得到的高質量unigene序列分別與Nr (NCBI non-redundant protein sequences)、Nt (NCBI nucleotide sequences)、Pfam (Protein family)、KOG/COG(euKaryotic Ortholog Groups/Clusters of Orthologous Groups of proteins)、Swiss-Prot(A manually annotated and reviewed protein sequence database)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、GO(Gene Ontology)等數據庫進行Blast比對(E-value<10-5，E-value表示假陽性率，E-value越小越好)，得到unigene功能注釋信息。

以“cell cycle”和“cyclin”為關鍵詞在三角帆蚌轉錄組庫中搜索，將篩選出的相關unigene進行基因注釋，用pathway分析篩選出cyclins相關unigene。用NCBI網站的Blast功能將cyclins相關unigene與牡蠣等水生軟體動物比對，選擇序列保守性高的unigene，結合不同插核時間三角帆蚌外套膜的數字基因表達譜(DGE)分析(實驗室已構建)，篩選出三角帆蚌中與細胞分裂密切相關的cyclins基因。

1.3 cyclins基因克隆和序列分析

通過轉錄組數據庫篩選得到cyclins基因序列，根據其保守區序列設計引物(引物設計要求退火溫度為55～60 ℃，GC含量為40%～60%)，引物序列見表1。PCR擴增模板選取三角帆蚌組織混合池cDNA。擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40個循環。擴增產物的回收純化使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(TaKaRa，日本)，與PMD19-T(TaKaRa，日本)連接后轉入大腸埃希菌DH5α中。采用菌落PCR驗證，驗證的陽性菌液于生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)分析序列的開放閱讀框，使用NCBI Blast分析比對氨基酸序列。使用DNAMAN軟件比對克隆的三角帆蚌與GenBank中同源物種的cyclins核苷酸和氨基酸序列，預測序列保守性。使用String(http://string-db.org)進行靶蛋白預測。

1.4 cyclins基因表達分析

取凍存的組織樣品用于RNA提取，RNA提取按照Trizol?Reaget(Invitrogen，美國)的操作說明進行，RNA純度、濃度與質量檢測與1.2.1節相同，反轉錄使用PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)。根據克隆得到的cyclins基因CDS區序列，用NCBI Primer Blast設計實時熒光定量PCR引物。以2×iQTMSYBR Green Supermix(Bio-Rad，美國)為熒光染料，選取EF1α為內參基因，反應體系：cDNA 1.0 μL，2×iQTMSYBR Green Supermix 10.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ddH2O補齊至20 μL。反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環。每個樣品5個生物學重復，3次技術重復，基因表達水平用2-ΔΔCT法計算。

1.5 數據處理

結果用平均值±標準誤差表示，采用SPSS 24.0對結果進行方差分析和組間多重比較，使用OriginPro 9.1軟件進行作圖分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 轉錄組unigene組裝和功能注釋

數據拼接后得到257 457條unigene，總核苷酸數193 448 860 bp，平均長度為751 bp，N50為1 796 bp。將所有的unigene在NCBI的非冗余蛋白質數據庫(Nr)進行相似搜索(E值<10-5)。

將unigenes分別與Nr、Nt、Swissprot、KO、GO、和KOG、PfAM數據庫比對注釋，成功注釋223 345條，注釋率為86.7%。Nr、Nt、Swissprot、KO、GO、KOG和PfAM數據庫分別注釋到的44 822、11 068、33 642、11 636、50 182、22 718和49 277條unigenes。

2.2 三角帆蚌細胞周期蛋白篩選結果

數據篩選結果表明，103條unigene與cyclins相關，64條unigene與cycle相關，130條unigene與CDK相關。將找到的103條cyclins相關unigene進行基因注釋和pathway分析，從中篩選出10個cyclins相關unigene(表2)，結合這10個相關unigene的開放閱讀框與靶蛋白預測結果，參考相關基因的文獻，篩選得到4個cyclins基因：cyclinA、cyclinB[18]、cyclinD2、cyclinE。

表2 三角帆蚌轉錄組文庫篩選的cyclins相關unigene

2.3 cyclins基因克隆與分析

克隆得到的三角帆蚌cyclinA基因的蛋白質編碼區(coding sequence，CDS)長度為413 bp，分析其氨基酸序列發現，第3～81 aa構成一個周期蛋白框(圖1)。與其他物種cyclin A的氨基酸序列比對結果(圖2)顯示，三角帆蚌cyclin A氨基酸序列與斑馬貽貝相似性最高，為84%；與美洲牡蠣和太平洋牡蠣的相似性為72%。String蛋白數據庫預測結果表明，三角帆蚌的cyclin A蛋白與CDK1、CDK2、細胞分裂周期基因6(CDC)能發生相互作用。

黑色框內為周期蛋白框。Black frame was the cyclin box.圖1 三角帆蚌cyclin A基因預測的氨基酸序列Fig.1 Predicted amino acid sequence of cyclin A gene in Hyriopsis cumingii

cyclin A氨基酸比對所用物種登錄號：斑馬貽貝，AAC35953.1；美洲牡蠣，XP_022320685.1；太平洋牡蠣，XP_034299932.1；蝦夷扇貝，XP_021364053.1；斑節對蝦，ACH72071.1；非洲爪蟾，NP_001081579.1；斑馬魚，AAH68323.2；長棘海星，XP_022085019.1。GenBank accession numbers of cyclin A: Dreissena polymorpha， AAC35953.1;Crassostrea virginica， XP_022320685.1; Crassostrea gigas， XP_034299932.1;Mizuhopecten yessoensis， XP_021364053.1;Penaeus monodon， ACH72071.1;Xenopus laevis， NP_001081579.1;Danio rerio， AAH68323.2;Acanthaster planci， XP_022085019.1.圖2 三角帆蚌與其他物種cyclin A氨基酸相似性序列比對Fig.2 Amino acid similarity alignment of cyclin A among Hyriopsis cumingii and other species

克隆得到的cyclinD2編碼的CDS區長度為501 bp，氨基酸序列分析表明第22～148 aa構成了一個周期蛋白框(圖3)。氨基酸序列比對結果(圖4)顯示，三角帆蚌cyclin D2氨基酸序列與美洲牡蠣、太平洋牡蠣相似性最高并聚為一支，相似性為77%，其次與蝦夷扇貝相似性較高，為76%。String蛋白數據庫預測表明，cyclin D2與細胞周期蛋白依賴性激酶6(cyclin-dependent kinase 6，CDK6)、細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)能發生相互作用。

黑色框內為cyclin box。Black frame was the cyclin box.圖3 三角帆蚌cyclin D2基因預測的氨基酸序列Fig.3 Predicted amino acid sequence of cyclin D2 gene in Hyriopsis cumingii

cyclin D2氨基酸比對所用物種登錄號：斑馬貽貝，AAM44813.1；美洲牡蠣，XP_022292709.1；太平洋牡蠣，XP_011430967.2；蝦夷扇貝，XP_021360132.1；非洲爪蟾，CAA61665.1；斑馬魚，NP_001082914.1；長棘海星，XP_022112210.1。GenBank accession numbers of cyclin D2: Dreissena polymorpha， AAM44813.1;Crassostrea virginica， XP_022292709.1;Crassostrea gigas， XP_011430967.2;Mizuhopecten yessoensis， XP_021360132.1;Xenopus laevis， CAA61665.1;Danio rerio， NP_001082914.1;Acanthaster planci， XP_022112210.1.圖4 三角帆蚌與其他物種cyclin D2氨基酸相似性序列比對Fig.4 Amino acid sequence similarity alignment of cyclin D2 among Hyriopsis cumingii and other species

克隆得到的cyclinE基因編碼的CDS區長度為415 bp，由于其氨基酸序列較短(圖5)，通過NCBI對其氨基酸序列進行分析未得到結果。氨基酸序列比對結果(圖6)顯示，三角帆蚌cyclin E氨基酸序列與蝦夷扇貝序列相似性最高，為65%，其次，與美洲牡蠣和太平洋牡蠣相似性較高且聚為一支，相似性為60%。String蛋白數據庫預測顯示，cyclin E能在細胞周期調控中與CDK1、CDK2、CDK4相互作用。

圖5 三角帆蚌cyclin E基因預測的氨基酸序列Fig.5 Predicted amino acid sequence of cyclin E gene in Hyriopsis cumingii

cyclin E氨基酸比對所用物種登錄號：美洲牡蠣，XP_022336414.1；太平洋牡蠣，XP_011433150.1；蝦夷扇貝，OWF54564.1；斑節對蝦，AGW23550.1；非洲爪蟾，CAA78370.1；斑馬魚，CAA58574.1；長棘海星，XP_022092193.1。GenBank accession numbers of cyclin E: Crassostrea virginica， XP_022336414.1;Crassostrea gigas， XP_011433150.1;Mizuhopecten yessoensis， OWF54564.1;Penaeus monodon， AGW23550.1;Xenopus laevis， CAA78370.1;Danio rerio， CAA58574.1; Acanthaster planci， XP_022092193.1.圖6 三角帆蚌與其他物種cyclin E氨基酸相似性序列比對Fig.6 Amino acid sequence similarity alignment of cyclin E among Hyriopsis cumingii and other species

2.4 cyclins基因組織表達分析

定量分析結果表明，三角帆蚌cyclins基因mRNA在閉殼肌、斧足、外套膜、心臟、血液、內臟團、鰓、性腺中均有表達，且呈現出不同的組織與性別差異。

cyclinA基因在三角帆蚌雌雄個體各個組織中均有表達，在性腺中表達量最高，顯著(P<0.05)高于其他組織，在血液、閉殼肌、內臟團、心臟中表達量也較高(圖7-A)。在心臟中，雌性cyclinA表達量顯著高于雄性(P<0.05)；在性腺中，雌性cyclinA表達量約為雄性的15倍，差異極顯著(P<0.01)；在閉殼肌和血液中，雄性cyclinA表達量顯著高于雌性(P<0.05)(圖7-B)。

組間無相同字母表示差異顯著(P<0.05)；*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同。Values without the same letters were significantly different (P<0.05);* indicated P<0.05， ** indicated P<0.01. The same as below.圖7 cyclin A基因的相對表達量Fig.7 Relative expression level of cyclin A

cyclinD2基因在三角帆蚌雌雄個體各個組織中均有表達，其中，在鰓中表達量顯著(P<0.05)高于其他組織，在斧足、外套膜、心臟中表達量也較高(圖8-A)。在外套膜中，雌性cyclinD2表達量顯著(P<0.05)高于雄性；在心臟和性腺中，雄性cyclinD2表達量均顯著(P<0.05)高于雌性，其他組織cyclinD2基因表達量無性別差異(圖8-B)。

圖8 cyclin D2基因的相對表達量Fig.8 Relative expression level ofcyclin D2

cyclinE基因在三角帆蚌雌雄個體各個組織中也均有表達，其中，在性腺中表達量顯著(P<0.05)高于其他組織，鰓、內臟團、閉殼肌、血液中表達量也較高(圖9-A)。在斧足、心臟中，雌性cyclinE表達量顯著(P<0.05)高于雄性；在性腺中，雌性cyclinE表達量約為雄性的5倍，差異極顯著(P<0.01)。在鰓中，雄性cyclinE表達量顯著(P<0.05)高于雌性(圖9-B)。

圖9 cyclin E基因的相對表達量Fig.9 Relative expression level of cyclin E

3 討論

細胞周期蛋白最早被發現于海膽中[20]，隨后在高等生物中鑒定出了多種細胞周期蛋白，各種周期蛋白通過與CDK結合調控細胞的分裂[21]。研究表明，細胞周期蛋白的表達失調與細胞凋亡、多種癌癥發生有密切關系[22]。本研究采用高通量測序技術，構建了三角帆蚌轉錄組文庫，從中篩選出了三角帆蚌cyclinA、cyclinD2、cyclinE基因，并進行了生物信息和表達分析。

通過氨基酸序列比對發現，三角帆蚌cyclin A、cyclin D2均具有周期蛋白標志性的周期蛋白框，而cyclin E因序列較短未得到比對結果。氨基酸序列相似性比對結果表明，三角帆蚌cyclin A、cyclin D2、cyclin E與牡蠣、扇貝等雙殼貝類氨基酸相似性較高，這進一步驗證了轉錄組所篩選出的基因為三角帆蚌細胞周期蛋白基因。

細胞周期的調控中，cyclin A、cyclin B被認為是M期周期蛋白，cyclin E是一類調節細胞周期G1-S期轉換的周期蛋白，cyclin A與cyclin B可以通過不同方式激活MPF，誘導減數分裂[23]。本實驗中，cyclinA、cyclinE基因在三角帆蚌性腺中的表達量最高，且顯著高于其他組織。Li等[8]在鱟(Tachypleustridentatus)中發現，cyclinA基因與卵巢發育密切相關，隨著卵巢的發育cyclinA表達量逐漸增加，卵巢發育過程中，大量細胞開始增殖，cyclinA基因的高表達與生殖細胞的分裂活動有關。劉佳敏等[18]研究表明，三角帆蚌cyclinB基因與cyclinA具有相似的組織表達特性，推測在細胞周期調控中，cyclinA、cyclinB可能發揮相似的功能。此外，Huang等[7]研究發現，在性腺組織中雌性擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)cyclinA表達量顯著高于雄性，本研究結果與此一致，暗示cyclinA在三角帆蚌卵巢發育過程中發揮重要作用，作為細胞分裂旺盛的組織，其與生殖細胞的分裂活動有關。cyclinE在水生動物性腺發育過程中的作用研究較少。趙超等[24]發現，在斑節對蝦(Penaeusmonodon)卵巢中cyclinE也存在高表達現象，暗示cyclinE基因與cyclinA相似，其表達可能也與性腺發育有密切關系。

cyclinD在G0期細胞受到有絲分裂原刺激后表達，是一類調控G1-S期轉變的周期蛋白，可作為一種細胞增殖潛能的指標，用于腫瘤發生的預后[25]。cyclinD1為原癌基因，在對人類多種腫瘤的研究中均發現cyclinD1基因的持續高表達[22，26]。本研究選用的三角帆蚌為5月份購置暫養的2齡蚌，此時為蚌的繁育時期，其受精卵發育在鰓套腔中進行[27]，且鰓是三角帆蚌重要的呼吸和濾食器官；研究中發現，三角帆蚌cyclinD2基因在鰓中的表達量顯著高于其他組織，暗示三角帆蚌鰓組織細胞具有較強的增殖能力，也可能與鰓細胞的損傷修復或處于繁育時期的生理狀態有關。