意大利蜜蜂amLDH基因的克隆與表達(dá)分析

歐陽霞輝， 鄭天宇， 徐文凱， 鄭相相

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶之一[1]，普遍分布于動物組織和各種微生物體內(nèi)，可借助輔酶(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的氧化型或還原型(NAD+或NADH)參與糖酵解中丙酮酸和乳酸的相互轉(zhuǎn)化[2]。在含氧豐富的組織中可將乳酸氧化為葡萄糖，從而為三羧酸循環(huán)提供充足原料；在缺氧狀態(tài)下可將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，從而保障碳代謝平衡[3-5]。LDH基因編碼的同工酶的生化特性多樣化，在不同的組織類型和發(fā)育狀態(tài)下，其表達(dá)水平差異顯著[6-7]。

自Abu-Shumays等[6]提出LDH活性隨類固醇激素(20-羥基蛻皮酮)的作用而增加以來，出現(xiàn)了許多其他物種LDH基因被成功克隆并進(jìn)行深入研究的報(bào)道[8]，如人[9]、鼠兔[10]、大鼠[11]、白絨山羊[12]和牦牛[13]等。Makler等[14]研究表明，寄生蟲血癥和寄生蟲LDH活性之間存在相關(guān)性。魏琳娜等[15]研究表明，乳酸脫氫酶在肝組織中的表達(dá)可催化無氧糖酵解為機(jī)體生命活動提供至少24%的ATP，從而增強(qiáng)對低氧環(huán)境的適應(yīng)。湛潤生等[16]對山西黑豬不同器官組織LDH同工酶的研究證明不同器官組織中LDH酶活性、種類和相對含量都存在顯著差異。黃興等[17]克隆了類烏齊牦牛乳酸脫氫酶基因，且其在牦牛肺臟中高表達(dá)，與牦牛的抗缺氧性狀有關(guān)。LDH在果蠅胚胎發(fā)育的能量代謝中發(fā)揮著重要作用[18]，且有研究表明LDH的表達(dá)與細(xì)胞周期相關(guān)[12]，而在蜜蜂等昆蟲中還鮮有報(bào)道。

本研究以經(jīng)濟(jì)昆蟲意大利蜜蜂(Apismellifera)為研究對象，克隆了amLDH基因，采用生物信息學(xué)方法對amLDH基因及其編碼蛋白進(jìn)行序列特征分析，并通過熒光實(shí)時定量PCR技術(shù)對意大利蜜蜂不同級型、不同發(fā)育階段amLDH基因的表達(dá)模式進(jìn)行了檢測分析，以期為進(jìn)一步研究該基因在蜜蜂能量代謝中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

意大利蜜蜂采自甘肅省蘭州市五泉王氏養(yǎng)蜂廠，不同級型、不同發(fā)育階段各取30只置凍存管中于-80 ℃保存，所取蜜蜂具體情況如下：工蜂選取卵期2～3日齡(G-2、G-3)；幼蟲期5～11日齡(G-5、G-7、G-9、G-11)；預(yù)蛹(G-Y)；白眼蛹(G-B)；紅眼蛹(G-H)；成蟲(G-C)。雄蜂選取卵期2～3日齡(X-2、X-3)；幼蟲期4～12日齡(X-4、X-6、X-8、X-10、X-12)；預(yù)蛹(X-Y)；白眼蛹(X-B)；紅眼蛹(X-H)；成蟲(X-C)。蜂王選取卵期2～3日齡(W-2、W-3)；幼蟲期4～7日齡(W-4、W-5、W-6、W-7)；預(yù)蛹(W-Y)；白眼蛹(W-B)；紅眼蛹(W-H)；蜂王成蟲(W-C)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA的合成

以Trizol法提取意大利蜜蜂總RNA，并以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA。按照寶生物公司PrimeScriptRT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書合成cDNA，產(chǎn)物置于-20 ℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank中已公布的LDH同源序列(登錄號：XM_394662.7)，利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長度為1 170 bp。根據(jù)所得amLDH基因序列及GenBank中已公布的意大利蜜蜂β-actin基因序列(登錄號：NM_001185146.1)，利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量PCR引物。引物均由上海生工生物股份有限公司合成，序列見表1。

表1 本研究所用引物信息

1.2.3amLDH基因的PCR擴(kuò)增

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10 μL：EXTaq酶5 μL、模板0.5 μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、ddH2O 4.1 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4amLDH基因的克隆和鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，以膠回收試劑盒回收目的片段，將純化回收后的目的片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5-α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布在含有Amp+、X-gal、IPTG的LB固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)。在培養(yǎng)板上挑取陽性克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)繁，過夜培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR陽性鑒定后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

amLDH基因序列在NCBI中經(jīng)BLAST序列比對，并使用ORF Finder進(jìn)行開放性閱讀框分析和氨基酸序列推導(dǎo)；利用DNASTAR以及MEGA 6.0進(jìn)行同源性分析并以NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹；使用ProtParam在線程序預(yù)測意大利蜜蜂amLDH蛋白的理化性質(zhì)；采用Motif Scan在線程序預(yù)測翻譯后修飾位點(diǎn)；通過InterPro預(yù)測amLDH功能域特征；利用PredictProtein在線預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；采用SWISS MODEL、Rasmol、TMpred在線預(yù)測并分析蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

1.2.6amLDH基因的表達(dá)分析

以意大利蜜蜂β-actin為內(nèi)參基因[19]，使用伯樂熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR檢測。反應(yīng)體系(20 μL)：2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性10 s，63 ℃退火30 s，40次循環(huán)。每個樣品3個平行重復(fù)，采用2-△△Ct法進(jìn)行基因相對表達(dá)量計(jì)算，并應(yīng)用SPSS 21進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增及序列分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，結(jié)果表明，引物特異性較好，且與預(yù)期擴(kuò)增長度大小符合。經(jīng)序列比對分析，確定是意大利蜜蜂LDH基因序列，并命名為amLDH，將序列提交至GenBank，登錄號為：MK714931。利用NCBI的ORF Finder分析后發(fā)現(xiàn)，該序列包含一個1 008 bp的開放閱讀框，編碼335個氨基酸。

M，DL2000 DNA marker；1，以水為模板的陰性對照；2，amLDH基因PCR產(chǎn)物。M， DL2000 DNA marker; 1， A negative control with water as the template; 2， PCR products of amLDH gene.圖1 意大利蜜蜂amLDH基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of amLDH gene in Apis mellifera

2.2 同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

采用DNA star軟件將該基因氨基酸序列與7種昆蟲的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與小蜜蜂(XM012485371.1)、中華蜜蜂(XM017059821.1)、大蜜蜂(XM006615361.1)、歐洲熊蜂(XM003396722.3)、家蠶(EU000385.1)、異色瓢蟲(HM362898.1)、馬鈴薯甲蟲(KX147667.1)的序列相似度分別為66.6%、96.4%、67.5%、83.5%、72.9%、70.1%、70.0%。進(jìn)一步使用MEGA6.0軟件以NJ法自舉檢驗(yàn)1 000次構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明(圖2)，amLDH在分子進(jìn)化上與中華蜜蜂關(guān)系最近，與其他4類膜翅目蜜蜂聚為一支，與鞘翅目昆蟲異色瓢蟲和馬鈴薯甲蟲的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)，這與實(shí)際的昆蟲進(jìn)化歷程是相符的，說明該基因在進(jìn)化過程中非常保守，采用其構(gòu)建的進(jìn)化樹能夠反映物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

圖2 采用NJ法構(gòu)建的amLDH基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of amLDH gene based on NJ method

2.3 amLDH的理化性質(zhì)及翻譯后修飾位點(diǎn)分析

采用ProtParam預(yù)測分析amLDH蛋白的分子量、分子組成及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)，結(jié)果顯示(表2)：amLDH理論分子量和等電點(diǎn)分別是36 597.19和6.66。氨基酸組成中，亮氨酸(Leu)占比最高，占總氨基酸的11.0%。不穩(wěn)定指數(shù)為29.67，低于域值40，其為穩(wěn)定蛋白。總親水性0.005，為疏水性蛋白。

表2 意大利蜜蜂amLDH的理化性質(zhì)

Motif Scan分析翻譯后修飾位點(diǎn)結(jié)果顯示：amLDH含有3個N-糖基化(ASN)位點(diǎn)、8個酪蛋白激酶II(CK2)磷酸化位點(diǎn)、5個豆蔻酰化(MYRISTYL)位點(diǎn)、4個蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)、1個酪氨酸激酶(TYR)磷酸化位點(diǎn)。

2.4 amLDH的二、三級結(jié)構(gòu)分析

PredictProtein預(yù)測分析amLDH二級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示：α-螺旋(H)9個，占比41.79%；β-折疊(E)12個，占比21.19%；無規(guī)則卷曲(L)占37.01%。SWISS-MODEL在線預(yù)測amLDH的三級結(jié)構(gòu)(模板：4aj4.1A，序列相似度：61.14%)，再經(jīng)Rasmal軟件處理(圖3)。其中綠色部位代表7個底物結(jié)合位點(diǎn)，其在二級結(jié)構(gòu)上相距甚遠(yuǎn)，但在空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近。使用TMpred預(yù)測蛋白跨膜區(qū)以及跨膜方向，結(jié)果表明，其存在三個跨膜區(qū)，分別為26aa-44aa，得分為1 085，螺旋形式由里向外；132aa-151aa，得分為651，螺旋形式由外向里；251aa-267aa，得分958，螺旋由里向外。

圖3 預(yù)測的amLDH蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.3 Predicted tertiary structure of amLDH protein

2.5 意大利蜜蜂amLDH基因表達(dá)模式分析

amLDH基因在意大利蜜蜂不同級型、不同發(fā)育階段均有表達(dá)，且差異顯著(P<0.05)。在工蜂發(fā)育的各個階段中(圖4-A)，卵前期和蛹期該基因表達(dá)量較低，卵期3日齡其表達(dá)量最高，卵期和從蛹期到成蟲期其表達(dá)量顯著升高。在雄蜂發(fā)育的各個階段中(圖4-B)，幼蟲期8、10日齡和成蟲期該基因表達(dá)量較低，卵期3日齡其表達(dá)量最高，從幼蟲期10日齡到預(yù)蛹期其表達(dá)量顯著升高，從卵期3日齡到幼蟲期10日齡以及從預(yù)蛹期到成蟲期其表達(dá)量呈下降趨勢。在蜂王發(fā)育的各個階段中(圖4-C)，卵前期、幼蟲期7日齡、蛹期和成蟲期該基因表達(dá)量較低，幼蟲期4日齡其表達(dá)量最高，從卵期2日齡到幼蟲期4日齡其表達(dá)量顯著升高，且在隨后的各個發(fā)育階段中其表達(dá)量整體降低。

柱狀圖上同個系列無相同小寫字母表示經(jīng)單因素方差分析各個時期組間差異顯著(P<0.05，Duncan氏多重比較法)。The bars without the same lower case letters in the same series showed significant differences among groups in different periods by one-way ANOVA (P<0.05， Duncan’s Multiple Comparison).圖4 amLDH基因在意大利蜜蜂工蜂、雄蜂、蜂王中的表達(dá)Fig.4 The expression of amLDH gene in Apis mellifera worker bees， drones and queen bees

通過折線圖對不同級型、不同時期該基因表達(dá)情況進(jìn)行對比分析結(jié)果表明(圖5)，蜂王從卵期到幼蟲期第一日(卵的孵化階段)該基因表達(dá)量具有較工蜂和雄蜂更大的升高趨勢，且蜂王幼蟲期該基因基因表達(dá)量都顯著高于工蜂和雄蜂。此外，蜂王蛹期該基因具有較工蜂和雄蜂更高的表達(dá)量，雄蜂次之，工蜂較前兩者最低。

L，卵期；F，孵化期；YD，幼蟲第一日；YZ，幼蟲最后一日；Y，預(yù)蛹；B，白眼蛹；H，紅眼蛹；C，成蟲。L， Egg stage; F， Hatching period; YD， First day of larval; YZ， Last day of larva; Y， Prepupa; B， White-eyed pupa; H， Red-eyed pupa; C， Adult.圖5 amLDH基因在不同級型、不同發(fā)育階段的意大利蜜蜂中的表達(dá)情況Fig.5 The expression of amLDH gene in different castes and different development stages of Apis mellifera

3 討論

LDH是一種極為重要的糖酵解酶，與能量代謝、細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖等密切相關(guān)，且在腫瘤細(xì)胞中LDH酶促反應(yīng)產(chǎn)生氧化態(tài)的輔酶Ⅰ可維持癌細(xì)胞的氧化還原平衡[20-21]。在人、鼠兔、大鼠、白絨山羊和牦牛等物種中關(guān)于該基因的研究已有不少報(bào)道，而在蜜蜂等昆蟲中還鮮見報(bào)道，鑒于LDH在糖酵解中的重要作用以及生物學(xué)效應(yīng)，在意大利蜜蜂中對該基因的研究十分必要。

本研究克隆得到了意大利蜜蜂amLDH基因，其中包含一個長為1 008 bp的開放性閱讀框，共編碼335個氨基酸，其氨基酸序列與中華蜜蜂和大蜜蜂的同源關(guān)系最近，同源性可在一定程度上反映基因序列的保守性，說明amLDH基因在進(jìn)化過程中具備較高的保守性。半衰期越長蛋白結(jié)構(gòu)則越穩(wěn)定，不穩(wěn)定指數(shù)小于40歸為穩(wěn)定蛋白[22]，且α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角化學(xué)鍵鍵能較高，不易扭曲變形，能夠維持蛋白的高級結(jié)構(gòu)[23]，意大利蜜蜂amLDH半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)小于40，且總親水性為0.005，同時α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角總占比達(dá)62.98%，說明amLDH為穩(wěn)定的疏水性蛋白。已有研究證實(shí)蛋白磷酸化是生物體內(nèi)普遍存在的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)方式[24]，調(diào)控著包括細(xì)胞的增殖發(fā)育和新陳代謝等幾乎整個生命活動過程[25]，意大利蜜蜂amLDH基因存在13個磷酸化位點(diǎn)，表明其在意大利蜜蜂的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中可能發(fā)揮著重要作用。

amLDH基因在意大利蜜蜂不同級型、不同發(fā)育階段均有表達(dá)(P<0.05)，表明其可能在意大利蜜蜂的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。蜜蜂幼蟲3～5日齡是級型分化的關(guān)鍵時期[26-27]，蜂王幼蟲初期amLDH基因表達(dá)量顯著高于工蜂，說明該基因與蜜蜂的級型分化相關(guān)。工蜂幼蟲孵化后，前三天取食蜂王漿，之后改食蜜粉混合物，在工蜂幼蟲發(fā)育前期該基因表達(dá)量急劇上升并達(dá)到最高，工蜂幼蟲基因表達(dá)量變化規(guī)律與發(fā)育情況相吻合，推測該基因可能與幼蟲的生長發(fā)育相關(guān)。

不同級型由卵孵化至幼蟲階段該基因表達(dá)量均呈上升趨勢，可能由于卵的孵化階段細(xì)胞活力增強(qiáng)，從而需要消耗更多的ATP及其他生物大分子(如氨基酸)，該基因參與糖酵解過程為機(jī)體生長發(fā)育提供大量能量，同時加速三羧酸循環(huán)以穩(wěn)定碳代謝平衡。蜂王整個發(fā)育過程歷時天數(shù)最少，顯然是為了滿足機(jī)體迅速發(fā)育的需求，因此在卵的孵化過程中該基因表達(dá)量上升趨勢較工蜂、雄蜂更為顯著，這與盧宜娟等[28]研究意大利蜜蜂蜂王幼蟲代謝率變化具有相似的規(guī)律，而在工蜂卵的孵化過程中該基因表達(dá)量上升趨勢較蜂王不顯著，可能由于工蜂幼蟲的代謝變化低于蜂王所致，同時符合工蜂的生長發(fā)育特點(diǎn)[29]。

在變態(tài)發(fā)育過程中蛹期的生殖器官及其他器官需要進(jìn)行高度的發(fā)育和分化，蜂王蛹期該基因具有較雄蜂和工蜂更高的表達(dá)量，雄蜂次之，工蜂較前兩者最低。工蜂屬于雌性，但生殖器官不發(fā)育，工蜂蛹期該基因表達(dá)量較雄蜂和蜂王最低，與預(yù)期相符。精子新陳代謝的主要能量途徑是糖酵解[30]，敲除LDH基因會導(dǎo)致精子中ATP數(shù)量減少，且精子活力和質(zhì)量都顯著下降[31-32]，雄蜂蛹期amLDH基因表達(dá)量較蜂王次之，推測其在雄蜂精子增殖及運(yùn)動過程中發(fā)揮著重要作用。卵丘細(xì)胞中通過糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸調(diào)控能量供給抑制卵母細(xì)胞老化并提供所需的能量[33]，蜂王蛹期amLDH基因表達(dá)量最高，推測其在卵巢等器官的發(fā)育過程中具有重要作用。

本研究系統(tǒng)地預(yù)測分析了amLDH蛋白的理化性質(zhì)及生物學(xué)功能，同時檢測并分析了該基因在意大利蜜蜂不同級型、不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，以期為進(jìn)一步闡明LDH在意大利蜜蜂生長與發(fā)育過程中的功能奠定基礎(chǔ)，為對糖酵解的深入研究提供理論依據(jù)。