化學發光免疫分析法檢測尿液中N1,N12-二乙酰精胺含量的研究

楊夢瑤 ，吳雨晴 ，劉辰辰 ，郭 宇，劉俊偉

(1. 天津國際生物醫藥聯合研究院 天津 300457；2. 南開大學藥學院 天津 300350)

有研究表明快速生長的組織一般都有活性的多胺合成體系，尤其是腫瘤的快速生長亦有賴于多胺含量的顯著增長[1]。作為精胺的二乙酰化衍生物，N1,N12-二乙酰精胺(N1,N12-diacetylspermine，DiAcSpm)對于非小細胞肺癌患者，尤其是Ia臨床階段患者的靈敏度比其他腫瘤標志物都要高[2]，并且尿液中的DiAcSpm可作為生存率的獨立預后因素[3-4]。圖1為N1,N12-二乙酰精胺的化學結構式。在不同臨床階段，DiAcSpm對結腸癌檢測的靈敏度也高于CEA和CA19-9[5]。同時，因為不同個體之間N1,N12-二乙酰精胺的尿液含量差別較小，所以通過DiAcSpm含量變化來檢測癌癥的發生相對于總多胺或其他多胺類化合物而言準確率較高[6-8]。

但是由于DiAcSpm缺乏伯氨基，再加上其在尿液中的含量低于0.5%，以常規的儀器分析手段無法滿足檢測需求，需用GC-MS、HPLC-MS以及MSICE-MS/MS[9-10]等高靈敏度檢測儀器。這些儀器檢測用時長、價格昂貴，無法滿足臨床上的日常檢測[11]。本研究以N1-乙酰精胺為半抗原，通過與載體蛋白偶聯制備出N1,N12-二乙酰精胺人工抗原，通過免疫動物獲得抗DiAcSpm特異性抗體，結合化學發光免疫分析法建立了可用于人體尿液樣本中N1,N12-二乙酰精胺的快速檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

N1-乙酰精胺(美國Cayman Chemical公司)；N1,N12-二乙酰精胺(美國Quality Control Chemicals公司)；戊二醛(50%)、牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、脫脂奶粉、Triton X-100、吐溫-20(上海生工生物工程有限公司)；明膠(蘇州亞科科技股份有限公司)；魚皮膠(德國Sigma-Aldrich 公司)；弗氏佐劑(德國Sigma-Aldrich 公司)；化學發光底物(湖州英創生物科技公司)；HRP-山羊抗兔IgG(英國Abcam公司)；BS3(美國Thermo Fisher Scientific公司)；大耳白兔(天津科奧公司)；Protein A親和層析柱(美國GE公司)；其他試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人工抗原與抗體的制備

以BS3為交聯劑，將半抗原N1-乙酰精胺與載體蛋白偶聯，制備二乙酰精胺人工抗原。通過免疫日本大耳白兔，獲得抗DiAcSpm血清。采用親和層析法純化得到抗DiAcSpm抗體，具體方法見參考文獻[12]。

1.2.2 化學發光免疫分析法檢測步驟

將包被原100μL/孔固定在96孔板中，37℃孵育2h后洗板。每孔加入200μL封閉1h后洗板。

每孔分別加入50μL標準品(或待測樣品)以及抗DiAcSpm抗體后37℃孵育，洗板后加入HRP-山羊抗兔IgG 100μL/孔，37℃孵育30min后洗板。加入化學發光底物后立即用化學發光儀測定每孔的相對發光強度(Relative light units，RLU)，并根據RUL計算抑制率，進而繪制標準曲線或計算待測樣含量。

1.2.3 實驗條件的優化

通過單因素實驗，本研究考察了包被原濃度、封閉液種類、一抗稀釋倍數、競爭反應時間以及化學發光底物稀釋倍數等參數對檢測性能的影響；通過比較半抑制濃度IC50及RLUmax/ IC50比值作為評價各影響因素的標準，確定最優反應條件[13]。

1.2.4 標準曲線的建立

按照以上確定好的優化條件進行化學發光檢測實驗，以DiAcSpm濃度為橫坐標、抑制率為縱坐標建立標準曲線。本研究以IC50值作為方法的靈敏度，以IC25值作為最低檢測限。

1.2.5 尿液樣品前處理

由于尿液成分復雜，可能會干擾對DiAcSpm含量的檢測，在實際檢測時必須對樣品進行前處理，以降低樣品本身對檢測的影響。本實驗嘗試不同的樣品稀釋液及不同的稀釋倍數，通過添加回收實驗確定了尿液樣品的前處理方法。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

通過對實驗參數進行摸索，確定了實驗參數：包被原濃度為2.5μg/mL；封閉液為脫脂奶粉/PBS；一抗稀釋倍數為3000倍；競爭反應時間為30min；HRP-山羊抗兔IgG的稀釋倍數為1×104倍；化學發光底物稀釋4倍。在此基礎上，本實驗建立化學發光免疫分析法的標準曲線，見圖2，得到線性回歸方程：

該檢測方法的靈敏度(IC50)為(1.74±0.09)ng/mL (n＝3)，最低檢出限(IC25)為(0.19±0.04)ng/mL (n＝3)。

2.2 尿液樣品前處理研究

本實驗以魚皮膠為掩蔽劑，通過不同濃度的溶液稀釋DiAcSpm而得到不同的抑制曲線，將其與標準曲線比較后，選取了抑制曲線重合程度最好的0.5%魚皮膠/PBS溶液為尿液樣品稀釋液。本實驗在尿液樣品稀釋2倍、5倍、10倍和20倍的基礎上分別進行了添加回收實驗，通過計算回收率的高低來確定樣品稀釋倍數。結果如表1所示：以2倍稀釋尿樣測得樣本添加回收率為98.2%～151.8%，以5倍稀釋尿樣測得樣本添加回收率為92.8%～104.1%，以10倍稀釋尿樣測得樣本添加回收率為79.7%～118.9%，以20倍稀釋尿樣測得樣本添加回收率為86.3%～135.2%，由此可見各個稀釋倍數均能滿足該檢測方法所需的準確度，但是為了減少尿液稀釋倍數且盡量減少尿液本身對檢測的影響，確保檢測結果的準確性，最終選擇以0.5%魚皮膠/PBS溶液稀釋5倍的處理方法。

表1 尿樣前處理中稀釋倍數選擇的結果Tab.1 Results of dilution fold selection in urine sample pretreatment

2.3 樣品準確性研究

本實驗選取了3份正常人尿液樣本，分別向其中添加了25ng/mL、50ng/mL和100ng/mL N1,N12-二乙酰精胺，在最佳實驗條件下測定并計算回收率。結果見表2。該方法的回收率在80.02%～102.69%之間，準確度和穩定性較好，可用于實際樣品檢測。

表2 尿液樣本中N1,N12-二乙酰精胺回收率測定(n＝3)Tab.2 Determination of recovery rate of N1,N12-diacetylspermine in urine samples(n＝3)

3 結論

本研究利用多克隆抗體建立的用于檢測人體尿液樣本的化學發光免疫分析方法，具有靈敏度高、準確度好，樣品前處理簡單等優點。其靈敏度(IC50)為(1.74±0.09)ng/mL，最低檢出限(IC25)為(0.19±0.04)ng/mL，尿液樣品的添加回收率為80.02%～102.69%。本研究將為N1,N12-二乙酰精胺的高效定量檢測提供借鑒，為開發快速檢測試劑盒奠定基礎，從而有利于在臨床上進行癌癥患者的早期篩查及預后評估。