酸敗的馬鹿初乳分離乳酸菌耐性研究

王曉文，岳喜慶，張俊偉，姜忠良

（1.沈陽農業大學食品科學院，遼寧沈陽110866；2.遼寧大學輕型產業學院，遼寧沈陽110036）

酸敗的馬鹿初乳分離乳酸菌耐性研究

王曉文1，2，岳喜慶1，張俊偉2，姜忠良2

（1.沈陽農業大學食品科學院，遼寧沈陽110866；2.遼寧大學輕型產業學院，遼寧沈陽110036）

從酸敗的馬鹿初乳中分離得到49株菌株，經革蘭氏染色和接觸酶試驗及生理生化試驗共計鑒定出12種乳酸菌，這些乳酸菌以中溫型乳酸菌為優勢菌。為鑒定馬鹿初乳中乳酸菌對機體的適應能力，對這12種乳酸菌進行耐性試驗，主要驗證其對人工胃液、人工腸液的耐受性，結果表明其中的4株乳酸菌耐酸性較強，以13號菌耐酸性最強，這將為未來開發鹿乳酸奶提供可靠地理論依據。

馬鹿初乳；酸敗；乳酸菌；體外耐受試驗

Abstract:49 bacterial strain was obtained from the lactic acid bacteria of rancid colostrum from Cervus elaphus and 12 of them was identified as lactobacillus by means of gram staining and enzyme contact test and the type of which is intermediate temperature.The tolerance experiment of the 12 strains of lactic acid bacteria was carried out to identify the adaptive capacity to the organism including the tolerance to the simulatedgastricfluid and the simulatedintestinalfluid.The resistance of 4 lactic acid bacteria of them to acid are stronger than the others and the No.13 is the strongest based on the results.These results will offer a reliable theoretical basis for the development of the Cervus elaphus yoghourt.

Key words：colostrum from Cervus elaphus;rancidity;lactic acid bacteria;tolerance experiment in vitro

馬鹿（Cervus elaphus），是屬于哺乳綱（Mammalia）偶蹄目（Artiodactyla）反芻亞目（Ruminantia）鹿科（Cervoidea）鹿亞科（Cervinae）鹿屬（Cervus）的動物[1]，它的別名為赤鹿、紅鹿、八叉鹿，是我國的國家Ⅱ級重點保護野生動物，同時還是重要的經濟動物和其具有極重要的生態價值。馬鹿的初乳為黃色、淡黃色或黃白色，異常地濃稠，黏性也很大，略帶有堿味和微臭味[2]。這是因為動物的初乳（指產后1 d~3 d的乳）內含有豐富的球蛋白、清蛋白、免疫體、白細胞、酶、維生素和溶菌素等[3]。

益生菌，是指定植于人體腸道內，能夠產生確切的健康功效的活的有益微生物總稱。作為益生菌的雙歧菌和乳酸菌，具有抗腫瘤、抑制有害微生物的生長、可以改善機體腸道內菌群的分布、調節機體膽固醇和乳糖的代謝，同時還可以促進機體對鈣的吸收和維生素的合成等。益生菌必須具有一定耐受機體的特性，如能夠耐受機體胃酸、耐受膽鹽、在機體腸道中定植及對宿主的安全性等[4-7]。自從益生菌的益生作用被證實以來，具有益生性能的新的菌株就不斷地被篩選和鑒定出來，同時也建立了許多在體外篩選益生菌方法[5，8-9]。本文從酸敗的馬鹿初乳中分離得到的乳酸菌進行耐性研究，以探討其潛在的益生性。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來源：遼寧省清原縣養鹿場，為第2天的馬鹿初乳。將采集后的馬鹿初乳置于30℃恒溫培養箱中進行培養，使其酸敗。

培養基及試劑：MRS培養基，人工胃液，人工腸液[10]。

1.2 方法

1.2.1 溫度耐受試驗

參照周德慶[11]的乳酸菌鑒定方法，在 10、15、40、45、50、60℃30 min 6個溫度梯度下，按2%的量接種供試菌液于5 mL經過濾、滅菌的MRS液體培養基中，每株菌在每一溫度條件下設2個重復，并在各溫度下設兩管空白對照，于生化培養箱內培養2 d或冰箱內培養2 d～5 d。目測菌懸液的渾濁度，記錄結果。

60℃30 min是指分離菌株接種后先在60℃恒溫培養30 min，然后在37℃下恒溫培養2 d。

1.2.2 pH耐受試驗及耐酸性菌株的初步篩選

參照周德慶[11]的方法，用1 mol/L的NaOH溶液或1 mol/L HCl溶液調節pH，制成不同pH梯度的MRS液體培養基（液體培養基過濾），pH的參數（25℃測定）為 3.5、4.3、4.5、6.5、8.5、9.6，按 2%的接種量接種于供試菌液，每一菌株在同一pH條件下設兩個重復，并在各pH梯度下設兩管空白對照，置于37℃恒溫培養48 h，以空白MRS液體培養基做對照，在600 nm波長處檢測其吸光值。

1.2.3 耐受pH為3.0人工胃液乳酸菌菌株的篩選

取MRS乳酸菌的菌懸液0.5 mL與4.5 mL、pH為3.0的人工胃液混合后，置于37℃培養箱中培養，分別在開始（0 h）和3 h后取樣品，測定其活菌數。

1.2.4 乳酸菌對人工消化液的耐受性測定

將篩選出的乳酸菌的MRS培養液經離心（3000 r/min，10 min）后收集其菌體，再用無菌生理鹽水離心洗滌2次，使其菌體懸浮于5 mL無菌生理鹽水中制成菌懸液。然后，將乳酸菌的菌懸液各0.5 mL分別接種于含4.5 mL過濾除菌處理的pH為2.0、3.0和4.0的人工胃液中，并置于37℃培養箱中培養，在開始（0 h）和培養1、2、3 h分別取樣，測定其樣品的活菌數。然后取在不同pH的人工胃液中已經消化了3 h的培養液0.5 mL，分別接種于4.5 mL過濾除菌的pH為8.0的人工腸液中，繼續置37℃培養箱中培養，并分別在0、3、6、24 h 測定其樣品的活菌數[12]。

1.2.5 發酵乳中的乳酸菌對人工消化液的耐受性測定

將供試乳酸菌，按2%（體積分數）的量接種于質量濃度為10 g/100 mL無菌脫脂乳中,置37℃培養箱中培養16 h后而制成發酵乳,分別吸取0.5 mL接種于pH 為 1.2、2.0、3.0、4.0和 5.0的 4.5 mL過濾除菌的人工胃液中，置于37℃培養箱中培養。分別在開始和培養1、2、3 h取樣，測定其樣品的活菌數。繼而取0.5 mL已在人工胃液處理3 h的樣品，接種于4.5 mL過濾除菌的pH為8.0的人工腸液中，繼續在37℃培養箱中培養，分別在 0、3、6、24 h 測定其樣品的活菌數[12]。

1.2.6 數據處理

以上試驗分別3次獨立試驗，每次試驗設3個重復。數據以X±sd形式表示，采用最小顯著性方差分析，P=0.05。

2 結果與分析

2.1 溫度耐受試驗

將分離得到的12個菌株分別接種于MRS液體培養基中，在不同的溫度下進行培養，觀察其生長情況，其結果如表1。

表1 溫度耐受性試驗Table 1 Temperature tolerance experiment

表1表明，在低溫的環境下，大部乳酸菌均不能生長，10℃培養時沒有菌種可以生長，可見低溫會抑制乳酸菌的生長，15℃培養時也只有13號和14號菌有一定的生長，但生長效果也不是很明顯。40℃和45℃這2個溫度下培養時大部分的乳酸菌都能生長，而且都能呈現出較強的生長趨勢，所以這兩個溫度是乳酸菌生長的最適生長溫度。而50℃培養時有些乳酸菌雖也能生長，但生長的效果不明顯，由此可以判斷分離出來的乳酸菌以中溫型乳酸菌為優勢菌（最適生長溫度40℃）。

2.2 pH耐受試驗

將分離得到的乳酸菌分別接種于不同pH的MRS液體培養基中，經培養后測定其菌懸液的吸光值，判斷其生長的最佳環境。測定生長后將吸光值繪制如圖1曲線。

圖1表明，這12株乳酸菌對不同pH的耐受能力有所不同。菌株在pH為3.5、4.3、4.5時，生長情況較差或者說幾乎不生長，而在中性（pH 6.5）或在偏堿性（pH 8.5）的條件下均可以生長，但在堿性條件下時生長效果并不是很好。所有菌種在pH為6.5時生長效果最佳，由此可以判斷乳酸菌的最適pH為6.5。

2.3 耐受pH為3.0人工胃液乳酸菌菌株的篩選

從自酸敗的馬鹿初乳中分離的12株乳酸菌，經過在pH為3.5的MRS液體培養基的生長和其在pH為3.0人工胃液中的存活率如表2所示。

表2 酸敗的馬鹿初乳分離乳酸菌在pH為3.5及pH為3.0人工胃液中的生長情況Table 2 The growth of lactic acid bacteria separated from the rancid colostrum of Cervus elaphus in artificial gastric(pH=3.5 and pH=3.0)

表2說明，在分離出的12種乳酸菌中，其中13、14、21、22、25、29、35、47 號菌株有一定的耐酸性，而在pH為3.0人工胃液中的存活率達50%只有4種，為13、29、35、47 號菌株。

2.4 乳酸菌對人工消化液的耐受性試驗

將以上得到的4株菌株經過pH為2.0，3.0和4.0的人工胃液消化3 h后，再分別接入pH為8.0的人工腸液，消化0、3、6、24 h后活菌數的變化如表3所示。

表3 耐酸性乳酸菌在人工胃液和腸液中消化后的存活數Table 3 The survive number of lactic acid bacteria which resistant to acid in the artificial gastric juice and intestinal juice for digestion

表3結果表明，這4株乳酸菌具有較強抗人工胃液消化能力，在pH為3.0和pH為4.0的人工胃液中持續消化3 h后其活菌數量不僅沒受影響，而且數量略有增加，其中13號菌株表現尤其明顯。這4株菌株經過不同pH人工胃液消化后再進入人工腸液消化24 h后，仍能保持較高數量的活菌，這一結果說明它們均對人工腸道消化液具有很好的耐受性。

2.5 發酵乳中的乳酸菌對人工消化液的耐受性測定

將13號菌接種于10%的無菌脫脂乳中，置37℃培養箱中培養16 h后，制成的發酵乳按1∶9比例與不同pH的人工胃液混合在37℃恒溫箱中消化3 h并進入人工腸液消化24 h后活菌數的變化見表4。

表4 13號菌制作的發酵乳在人工胃液和腸液中消化后的存活數Table 4 The survive number of fermented milk made by the bacterium of No.13 in the artificial gastric juice and intestinal juice for digestion

表4結果表明，發酵乳中的13號菌在pH為1.2的人工胃液中消化3 h后活菌數幾乎已經檢測不到；而在pH為2.0，3.0，4.0和5.0的人工胃液中消化3 h后，其存活數量幾乎未受影響。進入pH為8.0的人工腸液消化3 h和6 h后，活菌數變化不大，消化24 h后活菌數略有降低。發酵乳中的乳酸菌對人工胃腸液的耐受性顯著要高于單純菌液，這是由于乳中的成分對人工消化液起緩沖作用及對菌體保護作用所致。

3 結論

1）從遼寧省清原縣養鹿場得到的馬鹿初乳酸敗后分離出的12株乳酸菌中其優勢乳酸菌為40℃生長良好的中溫型乳酸菌。

2）分離得到的13號乳酸菌為乳桿菌，從其耐酸性上來看馬鹿初乳中乳桿菌的耐酸性要比乳球菌的耐酸性要強。

3）在pH為3.0人工胃液消化3 h后，存活率最高的菌株為13號株為乳桿菌其存活率為99%。各菌株在不同pH的人工消化液中其生存率的高低呈菌株依賴性和pH依賴性。13號菌株對人工腸液也有很好的耐受性。將13號菌株制成發酵乳后，其對人工胃消化腸液的耐受性要明顯高于單純菌體，這是由于乳中蛋白質對消化液起緩沖作用和對菌體起保護作用所致。

[1]侯扶江,常生華,于應文.我國鹿況簡介[J].草業科學,2003(11):47-50

[2]周小鸞.母鹿初乳的抽取與哺喂[J].特種養殖,新農村,2003(3):16

[3]趙世瑧.如何抽取母鹿初乳[J].特種養殖,中國農業科技,2000(4):26

[4]Fuller R.Probiotics[M]//The scientific basis.New York:Chapman and Hall,1992:398

[5]Marteau P,Minekus M,Havenaar R,et al.Survival of Lacticacid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine:validationandtheeffectsofbile[J].JDairySci,1997,80:1031-1037[6]DE SMET I,VAN HOORDE L,Vande woestyne M,et al.Signifi cance of bile salt hydrolyticactivities of Lactobacilli[J].Journal of applied bacteriology,1995,79:292-301

[7]Lankaputhra W E V,Shah N P.Survival of Lactobacillus acidophilusand Bifidobacterium spp in the presence of acid and bile salts[J].Cult Dairy Prod J,1995,30:2-7

[8]Pettersson L,Graf W,Alm L,et al.Survival of Lactobacillusacidophilus NCDO 1748 in the human gastrointestinal tract.1.Incubation with gastric juice in vitro[J].Symposia of the Swedish Nutrition Foundation,1983(15):123-127

[9]Kimoto H,Omurai M,Obayashi M,et al.Identification andprobiotic characteristics of Lactococcus strains from plant materials[J].Japan agricultural research quarterly,2004,38(2):111-117

[10]張和平,孟和畢力格,王俊國,等.分離自內蒙古傳統發酵酸馬奶中L.casei Zhang潛在益生特性的研究[J].中國乳品工業,2006,34(4):4-10

[11]周德慶.微生物學實驗手冊[M].上海:上海科學技術出版社,1986:56-59

[12]光岡知足.発酵微生物研究部特輯[M].ョーグルト用乳酸菌の効用,1994:3-1

The Study of the Tolerance of Lactic Acid Bacteria Separated from Rancid Colostrum of Cervus Elaphus

WANG Xiao-wen1,2,YUE Xi-qing1,ZHANG Jun-wei2,JIANG Zhong-liang2
(1.College of Food Science,Shenyang Agriculture University,Shenyang 110866,Liaoning,China;2.College of Light Industry,Liaoning University,Shenyang 110036,Liaoning,China）

2011-12-13

王曉文（1970—），女（漢），在讀碩土研究生，講師，研究方向：動物性食品研究。