瀘香型白酒窖泥微生物生態功能研究進展

張宿義，劉 淼，沈才洪，林 鋒，羅惠波，侯長軍，熊燕飛，楊 艷，李德林

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；2.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000）

白酒是世界六大蒸餾名酒之一，由于白酒的釀造工藝不同和地理環境的差異，形成了多種香型的白酒，瀘香型白酒(又被稱作濃香型白酒)產量及市場份額占據整個白酒行業的70%左右[1]，濃香型白酒以糧谷為主要原料，利用中高溫大曲為糖化發酵劑，采用泥窖固態法發酵，經蒸餾、陳釀、勾兌而成，具有綿柔甘洌、芳香濃郁、香味協調等特點。白酒釀造過程中，酒醅在環境微生物、大曲微生物、窖池微生物的相互作用下，以窖池為載體，經過復雜的物質能量代謝過程進行發酵[2]，濃香型大曲白酒生產的一個重要特征就是泥窖固態發酵，這就使得濃香型白酒對窖池依賴程度較大，然而窖池的功能載體是窖泥，由此說明，窖泥在白酒釀造的過程中發揮了重要作用，窖泥中相關功能微生物對白酒的口感與品質產生了較大的影響。因此，對窖泥中微生物的研究具有十分積極的意義。本文將對白酒窖泥微生物多樣性、主要功能微生物對白酒風味的貢獻以及新老窖泥的評價標準進行綜合介紹，并綜述濃香型窖泥微生物研究進展，以期為白酒生產提供理論指導。

1 窖泥在白酒中的作用

窖泥作為我國白酒釀造過程中特有的環境樣品，是一種高含水量、高腐殖質與低含氧量的特殊性土壤[3]。窖泥是濃香型白酒釀造過程中重要的微生物來源，部分微生物在發酵過程中進入白酒糟醅中繁殖和代謝，產生復雜多樣的代謝產物，形成種類豐富的風味物質，影響白酒風格和品質。白酒質量的優劣與窖泥微生物菌群多樣性息息相關[4]，正所謂“千年老窖，萬年糟”和“酒好全憑窖池老”[5]。優質窖泥中約富集了200 多種厭氧微生物，這些微生物經過長時間馴化與選擇，它們相互共生、同時相互競爭，通過復雜的相互作用，形成了穩定的生態系統[6]，同時，長期的白酒生產使窖泥微生物的種類逐漸穩定，同時產香味物質的功能微生物數量也呈上升趨勢。目前研究發現，新窖泥中以乳桿菌為主，而老窖泥中以梭菌綱、擬桿菌綱和產甲烷菌綱為主[7]。

窖泥是酒體生香功能微生物的繁殖載體，功能微生物協同發酵為酒體香味物質的形成提供反應底物，為濃香型白酒風味特征的形成奠定了基礎，窖泥可以產生大量的己酸菌，并通過己酸菌產生大量的己酸，進而與乙醇反應生成濃香型大曲酒的主體香—己酸乙酯[8]。在發酵過程中，窖泥通過發酵過程中產生的黃水的介導，與酒醅之間不斷進行微生物和物質能量的交換，為酒醅發酵提供豐富微生物種群的同時，又實現了窖泥自身的新陳代謝[9]。綜上所述，窖泥的主要作用為：(1)作為微生物的繁殖載體，向入窖酒糟中提供發酵產香微生物，發酵生成濃香型白酒中的香味物質；(2)發揮“以窖養糟”的作用，向酒糟中滲透其經過長期發酵吸附的揮發性微量香味成分，使酒味更加豐滿和諧。

2 白酒窖泥中功能微生物的多樣性

窖池的池壁泥和池底泥所處的理化環境差異很大，池底泥常年處于發酵過程所形成的黃水的浸泡中，更偏向為厭氧環境，而池壁泥中氧氣的含量更多，其所處的環境直到發酵后期才有可能成為厭氧狀態。因此，窖泥中的微生物多為嚴格厭氧和兼性厭氧的細菌和嚴格厭氧的古菌組成，窖泥中兼性及專性厭氧微生物主要包括乳酸菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、產己酸菌屬（Caproiciproducens）、梭菌屬（Clsotridium）、Petrimonas、嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）和甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）等原核微生物及酵母（Saccharomyces和Pichia）和霉菌（Rhizopus和Aspergillus等）等真核微生物[10-11]。值得一提的是，窖泥中細菌數量遠多于真菌，且窖泥中原核微生物群落α-多樣性及β-多樣性與窖泥窖齡及質量均有明顯的關聯性，如新窖和退化窖泥中厚壁菌門數量明顯多于老窖泥和優質窖泥，擬桿菌門和廣古菌門則相反[12]。

2.1 細菌群落多樣性

由于理化環境的差異，導致窖泥中細菌群落多樣性與真菌群落多樣性存在顯著差異，Zheng 等[13]、Ding 等[14]和湯斌等[15]對不同的地區窖泥研究發現，瀘州老窖窖泥細菌分類為梭菌科(Clostridiaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、互養菌科(Synergistaceae)、鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、Clostridiales Incertae Sedis XI、Lanchnospiraceae 和Plannococcaceae 共計8 個科；敘府酒業窖泥細菌歸屬于5 個科，包括乳桿菌科、梭菌科、互養菌科、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)和醋桿菌科(Acetobacteraceae)；而古井貢酒窖泥細菌僅被精確分類于真桿菌(Eubacterium)、梭菌、乳桿菌和互營單胞菌4 個屬。趙東等利用高通量測序技術解析五糧液窖泥原核微生物的群落結構，研究結果表明，五糧液窖泥與其他區域的濃香型窖泥微生物群落結構存在顯著差異。以上研究結果中乳桿菌科、梭菌科與互養菌科在不同地區窖泥中均被檢測到，說明不同地區的窖泥細菌群落結構存在顯著差異的同時，也存在一定的相關性。葉光斌等[16]利用克隆文庫分析窖泥細菌微生物群落，進一步證實芽孢桿菌綱、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Synergistetes(互養菌門)等為窖泥優勢微生物群落。同一地區，不同空間位置的窖泥微生物也存在差異性，胡曉龍等人采用高通量測序技術對老窖池(35 年)中4 個不同位置(窖壁上、中、下層和窖底)的窖泥原核微生物群落多樣性進行了解析，結果表明，厚壁菌門(71.1%)和擬桿菌門(16.3%)為供試窖泥的主要優勢菌門，群落α-多樣性(Chao1 和Shannon)分析表明不同位置窖泥之間存在差異但并不顯著(P＞0.05)。

李永博等[17]基于PLFA 組成的主成分分析對100 年窖齡窖泥與30 年窖齡窖泥進行微生物多樣性分析，結果表明，100年窖齡窖泥的微生物含量均高于30 年窖齡窖泥，且細菌的數量與豐度均高于其他類型微生物，對兩種不同窖齡窖泥磷脂脂肪酸含量進行主成分分析發現，其中30 年窖齡窖池中細菌為主要變異菌群，100 年窖齡窖池主要變異菌群為細菌與真菌。隨著窖齡增加，革蘭氏陽性菌與真菌對群落結構的影響減少，革蘭氏陰性菌與放線菌對群落結構的影響在增加。任聰等[18]通過對新、老窖泥的微生物菌群結構和進化關系，進一步發現窖泥中主體己酸菌為梭菌綱瘤胃菌科的己酸菌屬(Caproiciproducens)微生物，且以乳酸和葡萄糖利用型己酸菌為主。

2.2 真菌群落多樣性

真菌是窖泥微生物的重要組成部分，具有較高生物量[19]。但相關研究表明，窖泥真菌種類較少，僅分類為威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、曲霉屬(Aspergillus)、白地霉屬(Galactomyces)和地霉屬(Geotrichum)[14]。真菌多為好氧微生物，窖池厭氧環境不利于其生長，導致窖泥中真菌微生物多樣性較低。

2.3 窖泥微生物群落的演替

窖泥微生物演替是指隨窖齡的推移，窖泥微生物群落和生態環境定向有序的發展過程，演替的主要標志是群落在物種組成上發生了改變。

王明躍等[20]以克隆文庫技術對不同窖齡窖泥古菌進行研究，結果表明，通過16SrDNA 克隆文庫技術能夠系統地認識不同窖齡窖泥細菌群落的基本構成及演替規律。窖泥微生物在50 年前后變化明顯，50 年之前窖泥中古菌種群結構變化較大；50年之后，古菌群落結構趨于穩定。這與黃治國等[21]的研究結果相一致，結果發現窖齡越長，細菌群落結構越穩定。

2014 年，Tao 等[22]利用454 測序技術首次系統研究了窖泥細菌在1—50 年間的演替。該研究將演替分為起始馴化期(1年)、演替期(1—25年)、成熟期(25 年后)等3 個階段，其中窖泥pH 值、NH4+和乳酸的含量是影響細菌演替的主要因素，起始馴化期，窖泥富含乳桿菌屬，由于乳酸的積累使窖泥呈現高酸度環境。演替期，窖泥pH 值隨乳桿菌的衰亡和NH4+含量的增加而上升，擬桿菌門和螺旋體門(Spirochaetes)大量繁殖，細菌多樣性增加；有機酸、H2和CO2的含量不斷增加，促進了能促己酸生成的產甲烷菌(Methanogens)的生長。成熟期，細菌群落呈現穩定狀態，梭菌屬IV 簇、梭菌科和Anaerobrancaceae的豐度提高并與窖泥己酸含量呈顯著正相關(P＜0.01)，說明它們對己酸乙酯的生成具有積極作用。

3 窖泥中主要功能微生物對白酒風味的貢獻

3.1 產酸微生物對白酒風味的貢獻

酸類物質是濃香型白酒中的重要成分，是形成酯類物質和芳香化合物的重要前體[23]，濃香型白酒中主要酸類物質乙酸、乳酸、丁酸和己酸[24]對白酒風味有重要影響。勾文君等對不同窖齡濃香型白酒窖泥中產丁酸和己酸細菌進行研究，發現窖泥中梭菌綱(Clostridia)微生物所產生的丁酸及己酸、擬桿菌綱(Bacteroidia)和互營養菌綱(Synergistia)微生物產生的乙酸、丙酸等物質對酒體風味的形成發揮了重要作用。除此之外己酸菌(Caproiciproducens)與梭菌(Clostridiaceae_1)對維持窖泥中微生物群落結構穩定也有一定作用。董琪等[25]利用溴甲酚紫指示劑試管培養基和pH 計對窖泥中微生物進行篩選，經氣相色譜法測量后發現其中2 株菌可產生9種酸。由于窖泥中產酸微生物種類較多，且有機酸對白酒質量影響較大，因此對濃香型白酒窖泥中微生物與有機酸合成關系需進行更深入的研究。

3.2 產醇微生物對白酒風味的貢獻

白酒在發酵過程中除了產生大量乙醇外，在微生物的作用下通過酒精發酵途徑或相應氨基酸降解途徑還可生成高級醇[26]，此外部分酸類物質在一定條件下也會還原生成醇。高級醇是白酒中醇甜和助香的重要成分[27]，能與酸形成酯類物質使酒體豐滿。適量的高級醇可賦予酒體特殊的香味，使酯香更濃，但過量的高級醇使酒質變差，使人“上頭”，加重醉酒程度[28]。甄攀[29]對瀘州老窖不同窖齡的窖泥中高級醇進行研究，發現異戊醇和丙醇在所有窖泥樣品中均有檢出，其中異戊醇在樣品中分布均勻，丙醇在樣品中含量差異較大，但無明顯變化規律，正丁醇只在200 年以上窖齡中檢出。隨著窖齡增加，醇類物質總含量呈現下降趨勢[29]。何培新等[30]對某酒企窖泥進行分離純化，對其中8 個代表性梭菌菌株的揮發性代謝物進行檢測，得到23 種醇類物質，包括對濃香型白酒香氣貢獻度較大的3-甲基丁醇、2-乙基己醇及正戊醇等[31]，不同菌株合成醇類能力差異較大，3-苯丙醇、正辛醇、苯乙醇和正丁醇能被5 種及以上梭菌代表性菌株合成，而部分醇類僅能被一種菌株合成，因此可通過強化窖泥中特定微生物數量來增強白酒中特殊醇類香味。

3.3 產酯微生物對白酒風味的貢獻

酯類物質是白酒中芳香的主體，其中乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯被譽為濃香型白酒中“四大酯”[32]，酯類化合物大都具有較強的揮發性，具有果實氣味或獨特芳香氣味，因此表現出的氣味特征較強。乙酯類物質主要由有機酸和乙醇在一定條件下生成，此外部分梭菌屬微生物也可以合成酯類物質。何培新等發現克氏梭菌(C.kluyveri)等主要產生己酸、己酸乙酯，而C.cadaveris的含量與短鏈脂肪酸乙酯，即乙酸乙酯、丁酸乙酯的合成呈正相關。鄭佳等[33]對宜賓五糧液15 年窖池中不同空間位置窖泥進行頂空固相微萃取(HSSPME)并結合氣質聯用(GC/MS)進行分析，發現窖泥中總酯類物質隨著窖池深度的增高不斷增加，可能由于窖池中的物質交換主要通過“黃水”進行[34]，“黃水”在重力作用下下滲，造成底部窖泥酯類含量逐漸增加。魯少文等[35]研究發現，人工窖泥中加入新型瘤胃梭菌CPC-11可以顯著提高窖泥中己酸乙酯的含量，有助于窖泥中形成良好微生物群落，促進酯類物質積累，加快窖泥成熟。

3.4 產醛酮類微生物對白酒風味的貢獻

醛酮類物質也是瀘型酒中重要的風味組分，其中3-甲基丁醛和2-辛酮具有較高的香氣強度，糠醛呈現杏仁味、烤味，醛酮類化合物的存在極大的豐富了瀘型酒的香氣層次[36]；芳蒲秀鑫利用頂空固相微萃取結合氣相色譜質譜聯用儀對兩種不同窖泥中揮發性物質進行檢測，共檢測到9 種醛酮類物質。施珂等[36]發現瀘香型白酒中喃醛酮類化合物含量較少，可能由于該物質性質活潑，在萃取過程中可能轉化為其他物質。趙東在五糧濃香型糟醅及窖泥中發現3 種醛酮，分別是丙酮、2-戊酮、3-甲基丁醛。吳文睿等[37]對古井貢酒中芽孢桿菌進行研究，發現其中6株菌能大量產生3-羥基-2-丁酮，該物質具有奶油香味，可賦予酒體特殊的芳香氣味。

4 窖泥質量評價

窖泥作為白酒生產的重要部分，其質量好壞直接決定白酒的品質，目前對窖泥的評價主要分為以下幾個方面。

4.1 含水量

成熟窖泥中水分含量為30 %～50 %，水是微生物細胞的重要組成成分，在微生物體內起著運輸、溶劑、參與化學反應、構成生物體等作用，因此窖泥水分含量對窖泥品質有直接影響。研究發現，隨著窖齡增加，窖泥中水分含量呈上升趨勢。孟雅靜等[38]也發現老窖池池底窖泥中水分含量高于新窖池，而池壁窖泥水分含量則不存在顯著差異。胡曉龍等[39]研究發現退化窖池中窖泥呈現低含水量的特性。雖然不同地區品種的窖泥含水量之間存在較大差異，水分含量不能完全反映窖泥質量，但在人工老窖泥制作、窖泥日常養護、窖泥退化治理和窖池管理等方面水分含量具有重要作用[40]。

4.2 礦物元素

研究表明，新窖泥在成熟過程中可能會析出白色顆粒，產生窖泥“退化現象”，甚至板結[12]。劉大江等研究發現，窖泥中白色顆粒的主要物質為乳酸鈣。隨著新窖逐漸成熟變為老窖，窖泥中微生物種類和數量逐漸增加，乳酸鈣的含量會逐漸減少。張會敏等[3]通過研究濃香型白酒新老窖池中窖泥鈣含量、pH值、乳酸之間關系發現，在0～3 cm的厚度范圍內老窖泥中鈣含量、pH 值、乳酸相關性較強，而新窖泥三者相關性較弱，因此可通過檢測窖泥中鈣離子含量探究窖池的“退化”與“鈣化”。對老窖泥中Ca、K、Zn 進行檢測后發現其含量均高于新窖泥，Fe、Mg 含量基本保持不變，老窖泥中Mn 元素含量低于新窖泥[41-42]。王艷麗等[43]研究發現，不同品質的窖泥中鐵元素含量呈現差異，退化窖泥＞新窖泥＞優質窖泥，在退化窖泥中，由于受氧化還原電位的影響，鐵元素主要以Fe2+存在，和乳酸結合形成乳酸亞鐵，對窖泥中微生物造成毒害作用，從而使窖泥品質下降。微生物在生長過程中與某些無機鹽和微量元素息息相關，因此通過對窖泥中礦物元素的檢測可以了解微生物的生長情況。

4.3 有效磷

窖泥中的有效磷是指能被微生物所利用的酸溶性磷和吸附態磷[44]，其中ATP和ADP可為生物體提供能量，磷元素也是構成生物膜、核酸等的主要成分，有效磷的含量在一定程度上可反映窖泥中微生物的整體活性。王艷麗等[43]研究發現優質窖泥、新窖泥與退化窖泥相比，優質窖泥中有效磷含量高于新窖泥和退化窖泥，而且有效磷含量與窖泥中微生物數量呈現正相關。任道群等[45]對不同窖齡窖泥中有效磷進行研究也發現，隨著窖齡增加（窖泥質量上升），窖泥中有效磷含量呈現增加趨勢。

4.4 其他成分

窖泥中的銨態氮主要通過曲藥和窖泥中的微生物分解有機質而形成，李學思等發現窖泥中銨態氮隨著窖齡增加而增加，且窖底銨態氮含量高于窖壁，同時窖泥中速效鉀含量也呈現上述變化趨勢。王艷麗等[43]發現優質老窖泥中銨態氮＞新窖泥＞退化窖泥。

上述研究表明，不同時間、空間窖泥理化成分存在差異，但通過對同一產地或廠家窖泥進行監測，可以利用所測得的數據分析窖泥質量變化，相比于監測微生物種類與數量更為方便。

5 展望

濃香型白酒固態發酵過程中通過微生物菌群相互作用和獨特的生產工藝形成了濃香型大曲白酒窖香濃郁、綿甜爽洌的風格特征。窖泥中微生物群落結構的多樣性及復雜性，使得對窖泥微生物的研究進展緩慢。雖然現代分子生物技術已大量應用于窖泥微生物的研究，但是傳統微生物學技術對窖泥微生物的研究仍占有重要的地位。窖泥在白酒的生產中發揮了舉足輕重的作用，然而目前對窖泥的評價，依然沒有統一標準。在目前的生產中還是經常以窖齡長短、感官、產酒等指標來判斷窖泥的好壞。但是這些判定都存在一定局限性，無法數據化，只能依靠經驗。因此，為進一步掌握白酒窖泥微生物多樣性與窖泥質量以及在代謝上的關系，宏基因組學、微生物代謝組學等現代分子生物技術將有助于加深對窖泥微生物代謝活動的認識和了解窖泥微生物群落代謝機制，同時，如果明確了微生物在窖泥中的分布和功能，可以把微生物作為評價窖泥狀態的關鍵指標之一，更有利于對窖泥的評價。