膽固醇對人視網膜色素上皮細胞鈣轉運通道表達的影響

張敏，張朔，張鵬，趙洪禮

(1.沈陽大學生命科學與工程學院城市有害生物治理與生態安全遼寧省重點實驗室，沈陽 110044；2.沈陽百發科技有限公司，沈陽 110163；3.遼寧何氏醫學院基礎醫學院，沈陽 110163)

玻璃膜疣是黃斑老齡化的共同特征，是其最早期的眼底表現，是年齡相關性黃斑變性(agerelated macular degeneration，AMD)的重要危險因子，與AMD的進展密切相關[1]。如果玻璃膜疣的形成能夠被調整的話，AMD的發展進程可能延緩或者停止。已有研究[2-4]表明玻璃膜疣形成起始階段為在視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)下層微小羥基磷灰石球粒(不溶性堿性磷酸鈣)以含膽固醇的脂滴為核心沉積，而其外層被Aβ、玻連蛋白、補體因子H等蛋白質包被覆蓋。其中玻璃膜疣形成的起始成分為膽固醇，鈣元素在RPE下的積累特別是不溶性鈣的沉積加速了玻璃膜疣的形成進程。同時在細胞內鈣離子廣泛參與細胞信號轉導，如果大量的鈣離子內流引發鈣超載可造成細胞的損傷及凋亡[5-6]。本研究以細胞膜鈣ATP 酶1(plasma membrane Ca2+ATPase 1，PMCA1)、L型電壓依賴性鈣離子通道(L-type voltage-dependent calcium channel，LVDCC)和細胞膜鈉鈣交換蛋白1(sodium calcium exchange protein 1，NCX1)三個鈣轉運通道為代表，利用膽固醇培養人RPE細胞，分析RPE細胞鈣轉運相關通道蛋白表達水平上的變化，初步了解玻璃膜疣形成起始階段與RPE細胞鈣轉運狀態的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

ARPE-19細胞株購買自北納生物(細胞系，中國)；膽固醇(≥99%)購自美國Sigma公司；RIPA lysis buffer和BCA蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；PMCA1抗體購自于英國Abcam公司，NCX1和LVDCC抗體購自于美國Proteintech公司；熒光染料購自瑞士Roche公司的light cycler 480 SYBR Green I Master。

1.2 體外培養ARPE-19

將ARPE-19細胞株解凍離心后接種于含體積分數10%胎牛血清的DMEM/F12培養液中，置于37 ℃、體積分數為5% CO2培養箱中培養。生長至大部分細胞接近融合狀態時使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。繼代培養3～5代細胞用于后續實驗。

1.3 膽固醇處理ARPE-19 細胞

設置正常培養對照組和膽固醇處理組。具體方法見文獻[7]，對照組按上述體外培養ARPE-19 的方法正常培養。血液中的膽固醇濃度約為2 mg/mL。選擇以略高于血液中膽固醇的濃度培養，給予細胞一種類似于膽固醇在胞外略有積累的環境。正常培養條件下和膽固醇濃度2.5 mg/mL培養條件下分別取培養0、6、12、24、48、72 h不同時間的ARPE-19細胞樣品，液氮速凍后-80 ℃保存用于后續檢測。不同處理組光學顯微鏡下觀察取圖，記錄好培養過程中細胞變化。

1.4 實時定量PCR 檢測鈣轉運相關蛋白RNA 水平的變化

吸去細胞原培養液，PBS 清洗一次，用胰酶消化細胞，1000 r/min離心5 min，PBS重懸細胞，1000 r/min 離心5 min，棄上清。采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit進行R N A 提取，以g DNA Era ser 與R N A溶液混合在42 ℃共浴2 min去除基因組DNA，之后反轉錄試劑盒反轉錄獲得mRNA。采用熒光定量PCR(quantitative real time-PCR，qRT-PCR)技術檢測mRNA轉錄表達水平變化，以Tubulin為內參，利用Roche light cycler 480 SYBR Green I熒光染料反應、循環數Ct 值法在ABI熒光實時定量PCR儀上檢測分析。反應程序為：95 ℃ 10 min，30 cycles(95 ℃ 10 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s)，65～95 ℃ 0.5℃/5 s。LVDCC退火溫度為60 ℃。內參Tubulin和3個鈣轉運通道基因引物見表1。統計學軟件為Excel 17.0，利用方差分析進行顯著性檢驗，分別比較2個組不同處理時間與0 h時的表達變化。

1.5 蛋白質印跡法檢測

以R I PA蛋白裂解液裂解細胞提取細胞總蛋白，以BCA試劑盒檢測蛋白濃度。12%凝膠濃度進行SDS-PAGE電泳分離蛋白質，電轉PVDF模后一抗和二抗孵育，蛋白質印跡法檢測不同處理下的蛋白表達量變化。凝膠系統觀察取圖，以Tubulin蛋白為標準參照，用Image J軟件對圖片結果進行灰度掃描分析。

2 結果

2.1 膽固醇對RPE 細胞PMCA1、LVDCC 和CX1 轉錄水平表達的影響

通過實時定量PCR 檢測正常培養對照組和2.5 mg/mL膽固醇暴露處理0、6、12、24、48、72 h各時間段ARPE-19細胞中PMCA1、LVDCC和NCX1 mRNA表達的情況。結果表明：在正常培養條件下，隨著時間延長，PMCA1 mRNA表達略有升高，在72 h時有顯著升高。而膽固醇暴露的ARPE-19細胞中PMCA1 mRNA表達水平明顯低于對照組，從6 h開始到72 h PMCA1 mRNA表達顯著下調，在12 h表達水平最低，下調了約2倍，但未呈現時間依賴性(圖1A)。在正常培養條件下LVDCC mRNA表達也在72 h顯著升高；與對照組相比，膽固醇處理組長時間培養(24 h和48 h)LVDCC mRNA 表達明顯上調，24 h時表達上調了近4倍，差異具有統計學意義(P<0.05，圖1 B)。在正常培養條件下NCX1m RNA 表達水平隨時間延長無明顯變化，而膽固醇處理后NCX1 mRNA表達水平明顯高于對照組，特別是在24 h，表達上調了近6倍(圖1C)。在膽固醇處理組72 h時LVDCC 和NCX1 mRNA表達水平與處理24 h、48 h相比顯著下調，都是在處理時間超過24 h后表達出現回落，表現出一定的時間效應。這些結果表明：膽固醇處理下PMCA1轉錄水平表達顯著降低，LVDCC 和NCX1 轉錄水平表達上調。

圖1 膽固醇處理對PMCA1(A)、LVDCC(B)、NCX1(C)三個基因mRNA表達水平的影響Figure 1 The effect of cholesterol treatment on the mRNA expression levels of the three genes PMCA1 (A),LVDCC (B) and NCX1 (C)

2.2 膽固醇對RPE 細胞PMCA1、LVDCC 和NCX1蛋白質表達水平的影響

通過蛋白質印跡法檢測正常培養和2.5 mg/mL膽固醇處理0、6、12、24、48、72 h各時間段ARPE-19細胞中PMCA1、LVDCC和NCX1的蛋白質表達的情況(圖2)。結果表明：膽固醇處理24 h后PMCA1蛋白質含量明顯降低，特別是 72 h。膽固醇處理組的LVDCC和NCX1的蛋白質表達明顯增多，在48 h增加最明顯。

圖2 蛋白質印跡法檢測膽固醇處理對PMCA1、LVDCC、NCX1蛋白質表達水平的影響Figure 2 Western blot detection of the effect of cholesterol treatment on the protein expression levels of PMCA1,LVDCC and NCX1

為定量比較兩組蛋白表達的變化，對蛋白質印跡法結果進行了灰度分析(圖3)。加入膽固醇培養的ARPE-19細胞中PMCA1蛋白質含量隨時間延長不斷降低，最低在72 h，降低了約2倍(圖3A)。膽固醇處理組在48 h LVDCC蛋白質表達水平最高，增高了約4倍(圖3B)，NCX1蛋白質含量在膽固醇暴露48 h增加約1.7倍(圖3C)；兩個蛋白質的表達均是在72 h 略低于48 h。這些結果表明：膽固醇處理下PMCA1蛋白質表達明顯減少，LV D CC 和NC X 1 的蛋白質表達水平上調。

圖3 蛋白質印跡法檢測的灰度分析結果Figure 3 Gray analysis results of western blotting detection

3 討論

玻璃膜疣位于RPE層及Br uch膜之間，是由RPE細胞殘片、炎性因子、補體因子及補體激活物、脂褐素等堆積而成的細胞外沉積[1,7-8]。玻璃膜疣的出現與危害視力的黃斑病變，如視網膜色素上皮脫離、萎縮和脈絡膜新生血管的發生密切相關[9]。已有研究在實驗室培養過程中重建了僅依賴于RPE細胞的玻璃膜疣生物發生過程，表明RPE細胞可能是細胞外玻璃膜疣形成的起始和調控的關鍵位置[3-4]。RPE細胞具有轉運視色素、轉運營養成分和清除自由基等功能，RPE細胞功能正常對維持視網膜的功能和結構有重要意義。所以RPE功能異常可能既是玻璃膜疣形成的主要因素，也可能是玻璃膜疣形成后對RPE的影響結果，包括RPE細胞鈣離子轉運等功能。作為重要的第二信使，細胞內鈣離子參與調控細胞的增殖、分化、自噬和凋亡等過程，對于細胞活力的維持至關重要[6]。鈣離子穩態失衡可能會引起RPE細胞功能障礙和細胞凋亡，而RPE細胞漸進性功能障礙或凋亡在AMD的發病進程中起至關重要的作用，RPE細胞凋亡也是干性AMD早期病理改變之一[5,9-10]。起始階段以膽固醇為核心的脂滴在細胞外不溶性鈣的存在下加速滯留蛋白質，形成聚合體沉淀可能是玻璃膜疣形成的一種機制[2]。綜上所述，RPE細胞鈣離子穩態可能與玻璃膜疣形成關系密切，存在互相影響。

本研究以玻璃膜疣形成起始階段主要成分膽固醇作用于RPE細胞。通過檢測三個鈣離子相關轉運通道轉錄水平和蛋白質表達水平的變化，發現膽固醇使PMCA1表達減少，LVDCC和NCX1表達上調，且LVDCC表達上調倍數最大。其中PMCA1為細胞膜上將細胞內高濃度的鈣離子轉運至細胞外的鈣泵，而通過LVDCC進入細胞是細胞外鈣離子進入RPE細胞的主要方式，NCX1作為調控細胞內外鈣離子穩態重要的跨膜轉運蛋白，也是細胞內鈣變化的關鍵鈣通道[11-13]。LVDCC在膽固醇處理下明顯上調，可能促進細胞外鈣離子進入細胞。而PMCA1和NCX1的下調，則有可能引起細胞內鈣離子外排受阻。所以膽固醇暴露可能使RPE細胞的鈣離子外排受到抑制，引進鈣離子內流。膽固醇處理下NCX1和LVDCC的轉錄水平表達在24 h最高，之后48 h和7 h出現回落；其蛋白質水平表達在膽固醇處理48 h最多，在72 h略有降低，比轉錄水平表達增多的時間上略有延遲。這可能受處理時間延長導致死亡細胞增多的影響。玻璃膜疣形成起始階段脂質積累的刺激，可能引起RPE細胞鈣超載，從而導致細胞的凋亡。而死亡RPE細胞的碎片及鈣離子的釋放可能會繼續促進玻璃膜疣聚合體的形成。本研究探討了膽固醇對RPE細胞鈣離子轉運通道的影響，但膽固醇對RPE細胞凋亡的影響及此影響是否參與玻璃膜疣的形成過程尚需進一步探討。

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