絲素支架在肌肉骨骼組織工程的應用及研究進展

李艾元 施心雨 岳萬福

摘要：?肌肉骨骼系統包括骨骼、軟骨和骨骼肌肉，由于臨床修復和再生的迫切需求，其已經成為組織工程研究的主要目標。肌肉骨骼組織工程支架性能主要取決于支架播種的細胞和材料的結構。絲素蛋白組織工程支架的基本功能是將生長因子和種子細胞輸送到目標部位，以幫助損傷部位的修復與再生。絲素蛋白存在較好的生物相容性、可調節的生物降解性及優異的機械性而被認為是理想的材料。文章首先介紹了絲素支架在人類健康領域的重要性，其次介紹了支架材料的發展現狀，然后論述了不同形式（如薄膜、顆粒、電紡纖維、水凝膠、三維多孔腳手架）制造絲素蛋白仿生支架方面的最新研究，以及它們在肌肉骨骼組織再生方面的應用。最后，展望了絲素蛋白支架的未來發展方向。

關鍵詞：

支架;支架材料;肌肉骨骼組織工程;絲素蛋白;再生醫學;生物相容性

中圖分類號： R318.08

文獻標志碼： A

文章編號： 10017003（2021）11001805

引用頁碼： 111104

DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2021.11.004

Application and research progress of silk fibroin scaffold in musculoskeletal tissue engineering

LI Aiyuan， SHI Xinyu， YUE Wanfu

（College of Animal Science and Technology·College of Veterinary Medicine， Zhejiang Agriculture and Forestry University， Hangzhou 311300， China）

Abstract：

Musculoskeletal system including bone， cartilage and skeletal muscle， has become the primary target of tissue engineering research due to the urgent need for clinical repair and regeneration. The performance of musculoskeletal tissue engineering scaffolds mainly depends on the fabrication and structure of cells and materials seeded on scaffolds. The fundamental function of silk fibroin tissue engineering scaffolds is to transport growth factors and cells to the target sites for facilitating the repair and regeneration of the injuries. Silk fibroin is considered to be an ideal material for its good biocompatibility， adjustable biodegradability and excellent mechanical properties. This paper firstly introduces the importance of silk fibroin in human health and the development status of scaffold materials， and then elaborates the latest research on the manufacturing of silk cellulose biomimetic scaffolds in various forms， such as films， granules， electrospun fibers， hydrogels， and three-dimensional porous scaffolds， as well as their applications in musculoskeletal tissue regeneration. In the end of this paper， the future development direction of silk fibroin scaffolds is prospected.

Key words：

scaffold; scaffold material; musculoskeletal tissue engineering; silk fibroin; regenerative medicine; biocompatibility

基金項目： 浙江省高等學校訪問學者教師專業發展項目（2035170004）;浙江省科技廳湖羊肉用發展項目（2045210034）;農業部中蜂高效健康養殖集成及示范推廣項目（2060570001）

作者簡介： 李艾元（1995），男，碩士研究生，研究方向為動物學。通信作者：岳萬福，副教授，yuewanfuzju@aliyun.com。

過度運動和運動不當造成的器官損傷、功能衰竭是威脅人類健康的一個原因[1]，每年有數百萬病人死于器官疾病。肌肉骨骼組織包括骨骼、軟骨、肌腱、韌帶和骨骼肌肉，很容易受傷造成不可逆的影響[2]。然而，這些組織的恢復能力差，通常導致疼痛，關節不穩定，嚴重時甚至會導致殘疾。在臨床治療方法上，通常是用正常組織或器官替換受損部位[3]。人們面臨的關鍵問題是供體短缺，并且這種現象還會長期存在。同時，這種持續的現實性推動了組織工程的發展[4]。

自從利用活細胞制造人造組織的技術出現以來，組織工程領域已經有了很大的發展[5]。在過去的幾十年中，組織工程基質發生了從僅作為細胞附著的惰性結構支撐材料到作為組織發育的更復雜的動態環境的巨大變化[6]，未來的研究方向更強調為人工組織發育創造一個仿生微環境[7]。在這樣的背景下，以往一直被用作臨床縫合線[8]使用的絲素蛋白材料作為天然聚合物，正在成為組織工程有潛力的綠色材料[9]。

1 絲素仿生支架材料在肌肉骨骼組織工程的形態

1.1 多孔仿生支架前處理

由于殘留的絲膠蛋白可能導致生物不相容問題，所以肌肉骨骼組織工程中使用的絲素蛋白（Silk Fibroin，SF）應首先徹底去膠化[10]。目前形成了一套工廠化的生產方案：脫膠絲溶解、透析、離心，以獲得新鮮的SF溶液[11-12]。SF溶液可以制成薄膜、顆粒、電紡纖維、網、海綿、水凝膠和三維多孔支架，并已廣泛應用于肌肉骨骼、血管、皮膚和神經組織工程[13-14]。

表1為脫膠方法及脫膠程度等的匯總。

1.2 薄 膜

SF膜可以從SF溶液中獲得，也可以與其他聚合物或生長因子混合[20]。從溶液中獲得的SF膜由于大多數仍然是無規卷曲結構，導致SF膜具有水溶性，因此這種澆鑄的穩定性成膜率低[21]。為解決這一問題，應采用水退火、拉伸、醇浸等方法對鑄膜進行后處理，以提高膜表面的β折疊的結晶度[22]。此外，SF溶液的某些預處理也可以獲得水不溶性膜，例如控制干燥過程或向SF溶液中添加甘油[23]。

1.3 顆 粒

SF顆粒可以通過凍結干燥SF溶液或將固體SF磨成微/納米粒子來產生[24]，還可以通過自組裝、冷凍解凍、噴射破碎或噴霧干燥來制造絲素顆粒。雖然磨削顆粒這種物理方法通常用于改善仿生支架機械特性和細胞相容性，但可再生的SF顆粒主要用于藥物控釋載體。除了大特異性表面和生物相容性外，生物降解性使絲素顆粒在藥物輸送領域具有很大的優勢[25]。納米粒子在生物醫學領域的重要性日益提高，引起了許多研究人員的關注。

1.4 電紡纖維

電紡儀可以將SF變成表面凸起的生物材料[26-27]，粗糙的表面積有利于細胞黏附和增殖。當然制作過程需要適當的黏度溶液，溶劑會揮發，以防止紡紗纖維黏貼。全水過程生產的SF具有良好的生物相容性，然而直接獲取的SF溶液很難滿足電紡儀對材料的特定要求。纖維的直徑大小差異很大，形態不規則，因此，有機溶劑如六氟二醇（HFIP）和福微酸被廣泛使用[27]?；谟袡C溶劑的溶液可以很容易地制成纖維直徑相對均勻的電紡絲，但是這種方法同樣有缺點，殘余的有機溶劑會降低材料與細胞的相容性，同時還會刺激機體的免疫原性。絲素纖維可以制備成各種直徑的蛋白纖維材料，主要由溶液獲取方式和處理模式（黏度和電導率、場強度、流速、溫度、旋轉尖端與集合板之間的空間）等環境參數控制。電紡絲素纖維的結構穩定性也可以通過甲醇等有機溶劑處理進一步提高[26，28-29]。

1.5 三維多孔絲素支架

3D生物材料支架的高孔隙率對細胞黏附、生長和遷移至關重要[30]，必需的營養物質和代謝廢物都是通過多孔結構交換的。3D多孔支架通常由孔隙浸出、氣體發泡或凍干技術制成。凍干式多孔材料的結構參數，如強度和拉伸，可以通過控制冷凍溫度和溶液中SF的濃度來調節。通常，較低的冷凍溫度會導致毛孔尺寸變小，毛孔尺寸分布在幾十到幾百微米之間。冷凍干燥的支架具有良好的孔隙和孔結構[31]，而結構穩定性很差，提高β折疊的結晶度可以提高其穩定性。鹽浸式3D多孔支架的孔徑取決于孔原顆粒大小，其具有出色的連接結構、高孔隙度和易于調節的孔隙大小[32]。此外，鹽浸式3D多孔支架的結構是穩定的。這些優點使鹽浸式3D多孔支架在肌肉骨骼組織工程中常用[32]。

1.6 絲素蛋白水凝膠

水凝膠是以水為分散介質的3D聚合物網狀結構，其為細胞和生長因子的輸送提供了水環境[33]。此外，絲素蛋白水凝膠的物理性能與某些組織再生的承重需求相匹配[1]。SF水凝膠可以使用酒精、酸、聲波、離子或嗜酸劑等方法獲得，水凝膠中的結構主要是β折疊。SF水凝膠的凝膠過程可受SF溶液的pH值調節[31]，當pH值接近等電點時，凝膠時間將很短。SF凝膠時間還受SF濃度、凝膠溫度、離子濃度和超聲波功率等因素的影響。上述因素均與SF凝膠的時間負相關[34]。最近有報道表面活性劑可大幅縮短凝膠時間，這對于研發可注射凝膠系統有意義[35]。

1.7 復合支架

天然聚合物和合成聚合物已廣泛應用于肌肉骨骼組織工程[2]。聚乳酸（PLA）、聚氨酯（PU）、多丙烯酸等合成材料由于其特性（如降解時間、可塑性和機械特性），可制成有用的生物材料，用于定制某些特定功能組織。然而，上述的這些優勢也無法掩蓋其降解產物是酸性的缺點，由于對身體有害而限制了它們的發展前景。與合成聚合物相比，雖然膠原蛋白、彈性蛋白、明膠和石棉等天然生物聚合物可以嵌入式結合功能分子獲得更好的生物相容性，但材料加工難度高，而且不易得到良好的機械性能[36]。為了克服這些方法的局限性，人們開發了復合支架。組合制造是一種采用兩種或兩種以上制造技術制造支架的方法，如多孔支架/顆粒、多孔支架/膜、水凝膠/纖維，可以更好地滿足組織再生要求，并拓寬SF材料的使用范圍[37]。

2 絲素仿生支架在肌肉骨骼組織工程中的應用

2.1 骨組織工程

骨骼是一種結構復雜、高強度、高度血管化的生物結構，由70%的礦物質和30%的干重有機物組成的結締組織。骨組織包括鈣化細胞和骨細胞。骨骼的主要作用是支撐身體，防止體內器官受損，骨損傷或疾病將嚴重影響生活質量。在這一領域，已經產生各種多孔仿生支架，并研究了這些支架在骨骼再生中使用的影響。然而，能夠完全模仿原生骨骼結構的理想仿生支架仍然未能開發出來[38]。

絲素以其優良的生物相容性和良好的機械性能在體外骨骼修復重建中表現良好，可成功將骨骼間充質干細胞分化為成骨細胞。此外有報告稱，使用不同溶劑和工藝制作的支架用于骨組織工程時，最佳的孔徑在400～600 μm[39]。Uebersax等[40]用全水工藝獲得多孔SF支架制作頭骨缺陷模型，并測試絲素多孔支架的體內修復能力。活體動物試驗結果表明，經過長達8周的植入，檢測到了新的骨骼在缺陷處形成。然而，材料單一多孔的SF支架，通常不能滿足骨組織工程的機械需求。為了獲得具有令人滿意機械性能的絲素支架用于骨質組織形成，Rockwood等[41]用SF微粒加固了SF水凝膠。與SF水凝膠相比，彈性模量改進了6倍以上。隨著SF支架負荷的增加，絲素支架的機械性能顯著提高，同時鈣的吸收也大幅增強。

2.2 軟骨組織工程

軟骨組織使軟骨下骨免受關節內的高壓影響。軟骨沒有骨骼那么硬，因此可以有效地分配載荷，以避免大部分損傷。軟骨損傷通常與關節不穩定、劇烈疼痛有關[42]。然而，軟骨是一種無血管的結締組織，軟骨的自愈能力較差。其中，組織工程植入物仍然是最有潛力的一種綠色修復方法，為軟骨再生提供了一種有希望的途徑。Wang等[43]通過水性工藝制備了高度多孔的SF支架，并將其與人成纖維細胞（hMSCs）結合用于體外軟骨再生。在TGF-β3和地塞米松等誘導劑存在下，hMSCs在3D基質中沿軟骨形成途徑分化良好[44]。然后，研究人員在相同的SF支架上培養人軟骨細胞，發現細胞密度對軟骨細胞的分化起決定性作用。這項工作使細胞來源多樣化，并與SF基支架結合用于軟骨再生應用。在另一項研究中，Mandal等[45]設計了一個三層SF半月板材料系統，以模擬天然半月板結構。將人軟骨細胞和成纖維細胞以類似于天然組織的方式種植在支架上，機械性能的改善和細胞外基質ECM的共培養時間結果的一致性表明，該構建物是定向半月板樣組織生長的一個有希望的模板。

2.3 骨骼肌組織工程

骨骼肌也叫橫紋肌，是指將葡萄糖中儲存的化學能有效地轉化為機械能的組織，是生物體中最重要的功能器官之一。人體內有600多塊骨骼肌，可以引起生物體自身的運動和內臟器官的運動[46]?？v向排列的肌絲以肌動蛋白和肌球蛋白為主要成分構成骨骼肌纖維。創傷性損傷或肌肉萎縮等疾病可能導致肌肉功能損害，盡管已經做了很多嘗試，骨骼肌組織再生仍然是一個技術挑戰[47]。

SF有利于成肌細胞的增殖和分化。試驗證明，SF改性PU支架可用于下咽組織工程。Shen等[48]制備了一種SF的聚合（酯-氨基甲酸乙酯）支架，以改善其親水性和生物相容性。與對照組相比，骨骼肌細胞和人下咽成纖維細胞增殖分化良好，細胞毒性低，生物相容性好。在大鼠背部皮下植入SF支架后，發現其與周圍組織的生物相容性更好，降解速度更快[49]。

3 結 論

通過對國內外絲素支架研究總結，得到以下結論：

1）絲素蛋白能夠用作組織工程的原因是因為它良好的細胞相容性、緩慢的生物降解性和優異的機械性能;2）SF支架的特性可以通過調整其二級結構來調節，其中最重要的結構是β折疊;3）絲素蛋白支架能夠克服目前手術修復肌肉骨骼的弊端，屬于一種綠色的新型生物療法;4）絲素蛋白支架結合生長因子和其他細胞信號因子來優化細胞功能，支持干細胞生長和增殖;5）基于絲素蛋白的生物材料可以開發為一個可持續的、可生物降解的材料平臺，廣泛地應用在生物醫學方面。

與生長因子結合的生物材料已被證明提高了修復能力，盡管膠原蛋白、彈性蛋白、明膠和殼聚糖等天然生物聚合物由于嵌入功能分子的結構而提供了更好的生物相容性，但具有加工困難和機械性能差等局限性。絲素仿生支架的材料研究已經相當廣泛，然而，關于它們的臨床應用研究仍然很缺乏。因此，希望加強絲素仿生支架的材料的臨床應用研究的同時，進一步深化對絲素蛋白材料應用于各種組織器官組織工程材料的開發研究。

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