腫瘤微環境響應型19F-MR分子成像納米探針

胡雪松，衛佳楠，王洪斌，吳麗娜，王凱，孫夕林*

腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)是腫瘤細胞及其生活的內環境，不僅包括腫瘤細胞本身，還包括周圍的各種細胞及生物分子，在研究腫瘤發生、發展和生物學行為中起著重要作用。19世紀80年代Paget[1]首次提出“種子-土壤”理論，TME 作為為腫瘤生長提供營養支持的土壤，是腫瘤生理結構和功能的重要組成部分，為腫瘤的發生發展、侵襲、轉移等惡性生物學行為提供必需的營養環境[2]。分子影像學(molecular imaging)是在活體狀態下，應用影像學方法對人或動物體內的細胞和分子水平的生物學過程進行成像、定性和定量的研究。分子影像學作為一種多學科交叉、融合的學科，是醫學影像學的發展方向和未來，在監測腫瘤發生發展過程中TME 內的一些分子改變及環境變化方面具有巨大研究潛力，包括腫瘤細胞內pH改變[3-5]、大量新生血管生成[6-8]、腫瘤組織乏氧[9-11]、酶和蛋白質的異常表達[12-14]等，并能夠做出相應特異性診斷，判定預后，監測療效和腫瘤復發等情況，對基礎及臨床研究具有重大意義。

磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)具有高空間分辨率和深組織穿透能力，特別適合用于軟組織高分辨率成像[15-16]。與此同時，19F 原子高自旋量子數、高靈敏度(H 質子的83%，僅次于H)、廣泛化學位移和可忽略的人體背景信號等特點引起了研究者的興趣[17-19]。將19F-MRI與分子影像相結合，利用氟原子高磁敏感率、高生物安全性及高MR 成像能力的特點，可在分子水平上實時監測各組織器官的生物學行為。

納米醫學是將納米顆粒應用于疾病診斷和治療的一門學科，利用納米技術可將多種材料如金屬[20-22]、硅及二氧化硅[23-26]等應用于構建這類納米顆粒。迄今為止，已有大量納米藥物被設計用于治療各種疾病，尤其是針對于腫瘤的治療[27]。納米顆粒尺寸較小，通常在腫瘤組織的滯留和穿透方面發揮重要作用[28]。隨著納米技術的不斷發展，已設計出大量針對于TME 改變的智能環境響應型納米分子成像探針，這些探針能精準識別組織和器官的微小環境變化，使分子構象發生改變，并通過體外分子水平19F-MR 成像方式，早期識別異常。由于TME復雜多變，針對腫瘤pH、酶、各種離子、氧化還原變化等特性的TME 響應型納米分子成像探針的研究成為熱點，筆者對TME響應型19F-MR納米分子成像探針的特點及應用進行討論，以期為新型探針的制備提供理論依據。

1 pH響應型19F-MR納米分子成像探針

相對于正常組織(pH 為7.35～7.45)，TME 的pH 明顯降低，范圍在6.5～6.9 之間，這與腫瘤組織的糖酵解代謝上調以及乳酸生成增加有關[3]。近年來，針對TME 中pH 改變而設計的pH 響應型19F-MR 納米分子成像探針的研究成為熱點。Chen等[3]設計合成一種新型納米分子成像探針，由于葉酸受體在腫瘤細胞表面高表達，因此將葉酸偶聯到金納米粒子(AuNPs)表面，AuNPs再通過對酸不穩定的腙鍵共價偶聯到熒光功能化的介孔二氧化硅納米顆粒(FMSNs)上，得到Au-FMSNs，再將19F 對比劑六氟苯(C6F6)封裝于FMSNs 中，最終制得pH 響應型19F-MR納米分子成像探針C6F6@Au-FMSNs。對于pH為中性(pH=7.4)的正常細胞或PBS 溶液，pH 觸發的19F 生物傳感器未被激活，19F-MR 呈現低信號。而在pH 為酸性的TME 中，由于葉酸的主動靶向，探針能夠順利進入腫瘤細胞，腙鍵在細胞內酸性pH中被裂解，導致FMSNs 釋放19F 對比劑，19F 分子由束縛態變為液體狀態，弛豫時間有明顯改變，T1 大大縮短，19F-MR 信號明顯增強。通過對19F-MR 信號變化的監測，間接反映出TME 中pH值的變化，對腫瘤早期診斷和定位具有重要意義。

Zhu 等[29]將二甲基咪唑四氟硼酸鹽BMMIBF4封裝在可溶于酸性溶液的聚合物中，獲得pH 響應型19F-MR 納米分子成像探針。BMMIBF4被封裝后，19F信號消失，19F NMR峰明顯降低，說明BMMIBF4完全封裝于聚合物中(圖1)。將該探針在不同pH 條件下進行MR成像，結果顯示，在pH=7.4時被封裝的BMMIBF4的T2*非常短(T2*＜TE)，幾乎沒有19F信號；而當pH為6.4和5.0時，19F信號隨時間增加逐漸增強，提示pH 觸發的氟劑釋放導致MRI T2*延長，19F-MR信號開啟，且pH 5.0比pH 6.4的信噪比更高(達到188)。該探針的pH 響應特性能使其在細胞和分子水平對TME中pH改變做出響應，并通過MRI等成像手段對19F信號進行監測，及早察覺TME改變并做出相應治療策略。

2 離子響應型19F-MR納米分子成像探針

相對于正常細胞，腫瘤細胞內離子濃度尤其是Na+和Cl-濃度明顯升高[30-34]。Smith 等[33]研究結果也表明，與正常肝細胞相比，肝癌細胞中Na+和Cl-濃度增加了兩倍多。Zhang 等[35]研究發現腫瘤細胞內離子強度的變化會導致離子反應聚合物在溶液中的構象和遷移率發生改變，在鹽溶液中共聚物OEGMA-co-TFEA 中的OEGMA 側鏈上的醚氧原子可與Na+緊密結合，由于高氟化聚合物片段的聚集，TME中離子含量明顯升高，導致這些基團的T2弛豫時間非常短，19F-MR信號明顯降低。實驗中還發現，腫瘤細胞中的Na+濃度大約為癌前和正常乳腺細胞的3 倍，此外，在人乳腺癌MCF-7 腫瘤細胞中得到的19F NMR T2 值(82.3 ms)遠低于正常細胞T2 值(124.2 ms)。因此，這些離子聚合物納米分子成像探針的19F-MR T2可以作為一種非侵入性檢測指標，對TME中離子改變做出實時響應。

3 酶響應型19F-MR納米分子成像探針

酶涉及多種人類疾病，如癌癥、自身免疫性疾病等，在藥物開發和疾病診斷方面具有重要研究意義，對哺乳動物酶活性的檢測和成像亦可作為生物成像的最終目標之一[12]。半胱天冬酶-3 和-7 (Caspase-3 和-7)是細胞凋亡的標志，以酶原形式在細胞內胞漿中高表達，Caspase-3/7活性被用作評價誘導腫瘤細胞凋亡的抗腫瘤治療的生物標志物，且在凋亡早期表達情況明顯高于凋亡晚期及死細胞。利用這一特性，Akazawa等[12]設計了高度功能化且具有19F信號響應開關的納米分子成像探針FLAME-DEVD 2，其中FLAME 由液體全氟碳核和堅固的二氧化硅外殼組成；DEVD 2 是Caspase-3/7 酶的底物肽序列，該探針表面通過DEVD 2連接Gd3+復合物，基于其順磁弛豫增強效應(proton relaxation enhancement，PRE)，即順磁分子中的未成對電子與原子核之間的偶極-偶極相互作用引起原子核弛豫速率加快的現象[36]，探針中PFCs 的T2 值被有效抑制，19F-MR 信號減弱。而在腫瘤組織微環境中，Caspase-3/7 酶高表達，納米探針進入后，Caspase-3/7 酶可裂解底物肽DEVD 2，使Gd3+復合物與FLAME 分離，淬滅作用消失，T2值延長，19F-MR信號顯著增強。

酯酶是一類廣泛應用于生物技術領域的酶，具有催化酯類水解的功能，在腫瘤組織中高表達，通過調節機體內蛋白質的活性參與物質代謝、運輸和基因表達等生物過程[37-38]?；诩{米分子成像探針的酶響應特性，Guo 等[39]設計了一種酶響應型19F-MR 上轉換發光納米探針Gd3+-NaYF4:Yb3+/Er3+，用于檢測TME 中磷脂酶A2 (PLA2)活性。該探針以全氟-15-冠-5-醚(PFCE)為疏水核心，配以磷脂殼層，基于19F-MR 信號T2 的PRE 效應，當一個氟化基團通過酶底物與Gd3+配合物連接時，19F-MR 信號被Gd3+淬滅。PLA2 在多種病理條件下存在[40-42]。因此這些納米分子成像探針進入TME后，由于PLA2的含量增多，導致磷脂殼降解，19F核的流動性增加，氟原子的T2 弛豫時間延長，19F NMR顯示91.9 ppm處單線態峰的信號顯著增加，19F-MR 信號開啟，并且在5.0～200 U/L 范圍內隨PLA2含量的增加，19F-MRI信號呈線性增強趨勢。

4 還原響應型19F-MR納米分子成像探針

腫瘤細胞的快速生長將導致細胞數量急劇增多、體積迅速增大，從而導致組織供血不足，進而引發腫瘤細胞乏氧及酸性微環境的產生[9]。針對腫瘤組織乏氧的特點，Kadakia 等[43]設計一種可同時利用19F-MR和熒光兩種手段檢測細胞缺氧狀況的雙模態納米分子成像探針CuATSMF3-Fl。正常組織中由于Cu2+存在導致19F 和熒光信號淬滅，探針在19F NMR 譜中未出現峰值，無19F-MR 信號產生。而在低氧的TME 中，Cu2+被還原為Cu+，淬滅作用消失，相應19F-MR和熒光信號在納米探針的配體支架脫膜時開啟，在19F NMR 譜圖中70.2 ppm處可觀察到尖銳的峰，19F-MR 和熒光信號均明顯增強。利用該納米分子成像探針的還原響應特性結合19F-MR成像通過對TME的檢測能夠鑒別出正常細胞和乏氧細胞，早期識別低氧腫瘤，實現腫瘤早期診斷及治療。

Tang 等[44]設計并合成一種兩親性氧化還原反應響應型19F 聚合物和近紅外吸收吲哚箐綠(ICG)分子自組裝的級聯多響應型19F NMR 納米分子成像探針1-ICG NPs。探針含有19F 基團，通過可被還原裂解的二硫鍵連接到聚乙二醇上。由于自組裝限制，19FNMR 未檢測到峰值；而當1-ICG NPs 溶液與還原型谷胱甘肽共同孵育后，二硫鍵斷裂，19F NMR 顯示在62.7 ppm 處有19F 峰出現并逐漸升高，信噪比呈不斷增加趨勢，隨后在外部施加808 nm的激光治療，19F NMR出現更高、更尖銳的峰，出現明顯的第二次19F-MR 信號放大。級聯過程產生的最大信噪比約提高64 倍。利用該納米分子成像探針的分步雙級信號激活放大響應特性，可有效提高19F-MR對TME的診斷靈敏度。

5 總結與展望

隨著納米技術的不斷發展，研究者們設計研發出種類繁多的智能環境響應型納米分子成像探針，這些納米分子成像探針具有特異靶向性、高信噪比及原位顯示深部組織等優勢，特別是，在其合成過程中加入19F 小分子核團，這類新型納米探針在腫瘤復雜微環境改變的特定刺激下，構象發生改變，19F核團暴露，從而使19F-MR 信號明顯升高，最終達到19F-MR 腫瘤微環境分子成像的目的。同時，隨著一些硬件軟件技術，如雙1H/19F 射頻線圈和超快脈沖序列的不斷研發，19F-MR 的精度和靈敏度得到極大提高，對氟信號的檢測敏感度更高。但是，TME 復雜多樣，變化不盡相同，智能環境響應型19F-MR 納米分子成像探針合成過程中又涉及多種級聯反應，設計及操作步驟復雜，這都為研發性能優越的智能環境響應型19F-MR 納米分子成像探針帶來了巨大的挑戰。但相信不久的將來，通過研究者們不斷努力，這些瓶頸問題一定會被逐一攻克，使基于智能環境響應型納米探針的腫瘤19F-MR 微環境分子成像能夠在體敏感地針對TME變化做出精準監測，從而為TME分子水平在體動態可視化、研究TME 分子機制、及時研發全新的診斷及治療策略開辟全新的技術方法和途徑。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。