探討多重PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用與展望

□ 閆倩倩 秦皇島市食品藥品檢驗(yàn)中心

多 重PCR技 術(shù) 于1988年 被Chamberlain等研究人員提出，經(jīng)過多年的發(fā)展，在病原體檢測(cè)、遺傳病檢測(cè)等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，以及食品病原微生物檢測(cè)、食品原料溯源等食品領(lǐng)域取得了較大的發(fā)展。本文主要從食品安全檢測(cè)方面來(lái)探討多重PCR技術(shù)的應(yīng)用途徑及其具體的展望，目的是進(jìn)一步探索其利用空間，推動(dòng)其更為廣泛的應(yīng)用，以此來(lái)保障當(dāng)前市場(chǎng)上的食品安全。

1 多重PCR技術(shù)概述

多重PCR技術(shù)又稱復(fù)合PCR技術(shù)、多重引物PCR，是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行不斷改進(jìn)，形成的一種應(yīng)用范圍更廣、更加有效的PCR新技術(shù)。一般情況下PCR技術(shù)會(huì)選擇單一引物來(lái)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，但是多重PCR技術(shù)會(huì)在本身體系結(jié)構(gòu)中增添更多的引物來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增，目標(biāo)片段之間有著較大的差異性，因此在經(jīng)過多重PCR技術(shù)擴(kuò)增后，凝膠成像能直接進(jìn)行分析，與常規(guī)PCR技術(shù)相比，多重PCR技術(shù)可節(jié)約成本、時(shí)間以及模 板DNA。

多重PCR技術(shù)以常規(guī)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，利用脫氧核糖核苷酸、多對(duì)引物、模板DNA，并依靠DNA聚合酶進(jìn)行促合成反應(yīng)，其表現(xiàn)出一定的高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性。在高效性方面，在同一階段、同一體系中能夠利用該項(xiàng)技術(shù)檢測(cè)多種形式的病原菌以及目標(biāo)基因等；在系統(tǒng)性方面，該項(xiàng)技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)同一癥狀不同形式的病原菌，提升檢測(cè)效率；在經(jīng)濟(jì)性方面，同一體系能夠完成多種形式的反應(yīng)，較大程度地縮短了檢測(cè)時(shí)間、節(jié)省了檢測(cè)材料[1]。

2 多重PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 單一病原細(xì)菌檢測(cè)

2.1.1 沙門菌檢測(cè)

沙門菌血清型復(fù)雜，應(yīng)用常規(guī)PCR檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，其本身特異性較差，因此有較大的局限性。多重PCR技術(shù)可選擇沙門菌中數(shù)個(gè)相對(duì)保守的基因序列，以引物來(lái)實(shí)現(xiàn)自身的擴(kuò)增，以此來(lái)凸顯自身的特異性特征，并降低假陽(yáng)性的出現(xiàn)。沙門菌能導(dǎo)致人體出現(xiàn)傷寒、敗血癥等疾病，在設(shè)計(jì)其具體的引物基因時(shí)可從血清型與血清群兩種形式的特異性基因著手。部分學(xué)生在綜合分析了各種類型沙門菌具體類型后，對(duì)其進(jìn)行了專項(xiàng)引物設(shè)計(jì)，然后依次為基礎(chǔ)應(yīng)用多重PCR技術(shù)進(jìn)行對(duì)應(yīng)的檢測(cè)工作，發(fā)現(xiàn)可特異性檢出腸炎沙門菌的敏感度達(dá)到了95%，遠(yuǎn)高于一般細(xì)菌學(xué)檢測(cè)的92.5%

2.1.2 副溶血性弧菌檢測(cè)

副溶血性弧菌較為常見，主要存在于近海貝類、魚類等海產(chǎn)品中，會(huì)引發(fā)心臟病、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、食物中毒等病癥。Bej等結(jié)合相對(duì)耐熱直接溶血素的crh基因、耐熱直接溶血素的tdh基因以及副溶血性弧菌編碼不耐熱溶血素的dh基因進(jìn)行了引物設(shè)計(jì)，緊接著應(yīng)用多重PCR檢測(cè)樣品中包含的副溶血性弧菌，發(fā)現(xiàn)其特異性強(qiáng)、敏感性高，能夠很好地進(jìn)行毒株與非產(chǎn)毒株區(qū)分，相比于傳統(tǒng)形式的病菌測(cè)試有著較大的優(yōu)勢(shì)[2]。

2.2 多重PCR檢測(cè)

2.2.1 多重PCR檢測(cè)多種病原菌

在一根PCR反應(yīng)管中，同一階段在反應(yīng)管中加入各種病原菌引物，通過種方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能對(duì)其中存在的病原細(xì)菌進(jìn)行多方面的檢測(cè)，從而發(fā)掘其中存在的各種形式的病原細(xì)菌。目前很多病原菌只需少量即可對(duì)人體造成較大的威脅，1 cfu至10 cfu的菌體細(xì)胞已能夠致命。Ramesh等對(duì)現(xiàn)行的DNA提取方式進(jìn)行了改良，選擇多重PCR進(jìn)行牛奶中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，且不需要再進(jìn)行增菌檢測(cè)，敏感性為104cfu/mL，但需雜交鑒定PCR產(chǎn)物。但是以上方法在一些層面仍舊難以滿足食品樣品檢測(cè)在敏感性方面的要求，因此需對(duì)食品樣品目標(biāo)菌實(shí)施增菌 培養(yǎng)[3]。

一般情況下，一種病原細(xì)菌對(duì)應(yīng)一種類型的增菌培養(yǎng)基，因此應(yīng)用多重PCR進(jìn)行檢測(cè)時(shí)就需含有多種病原細(xì)菌的培養(yǎng)基來(lái)支持，提升檢測(cè)效率的同時(shí)降低成本。應(yīng)用較多的非選擇性增菌培養(yǎng)基包括：蛋白緩沖水、胰酶大豆肉湯、營(yíng)養(yǎng)肉湯等，當(dāng)前研究階段能同時(shí)集聚各種類型病原細(xì)菌的培養(yǎng)基不多，其中應(yīng)用較為普遍的是預(yù)增菌肉湯，其具備單核增生李斯特菌、大腸桿菌、沙門菌等多種原細(xì)菌。Kawasaki S等借助多重PCR同一時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)肉類中包含的大腸桿菌、李斯特菌、沙門菌，應(yīng)用預(yù)增菌肉湯，并進(jìn)行增菌，能使之達(dá)到1 cfu/25g的檢測(cè)敏感性[4]。

2.2.2 真?zhèn)舞b別檢測(cè)

對(duì)食品真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別很有必要，特別對(duì)肉類加工食品進(jìn)行鑒別可避免無(wú)良廠商以次充好，應(yīng)用多重PCR技術(shù)對(duì)動(dòng)植物源性、肉類摻假的成分進(jìn)行檢測(cè)，能取得較好的檢測(cè)效果。在鑒定肉類食品成分時(shí)，通常會(huì)選 擇 位 于mtDNA上 的165rDNA、12SrDNA、細(xì)胞色素b基因等，對(duì)各種形式的物種而選擇對(duì)應(yīng)的特異性引物，鑒定不同種類肉類成分的加工食 品。Yin等 以12SrDNA為基礎(chǔ)進(jìn)行了三對(duì)引物的設(shè)計(jì)，使得在檢測(cè)耗牛肉與普通牛肉的二元混合物時(shí)檢出限達(dá)0.1%。而Soares等通過多重PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了家禽、反芻動(dòng)物、豬等肉類食品的檢測(cè)。而蘇葳藝等則是對(duì)牛肉樣品中的鼠肉、雞肉、豬肉成分等進(jìn)行了多重PCR擴(kuò)增，檢出限 達(dá)1%。

3 多重PCR技術(shù)應(yīng)用展望

多重PCR技術(shù)，突出快速高效以及節(jié)約成本的特點(diǎn)，可進(jìn)行多種目標(biāo)片段的同時(shí)檢測(cè)，并且在未來(lái)會(huì)實(shí)現(xiàn)與其他方式結(jié)合應(yīng)用，比如AFLP多重、多重逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量多重等方面的PCR技術(shù)，可廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)的各個(gè)方面。此外，還會(huì)集中在以下3個(gè)方面：①引物對(duì)數(shù)會(huì)基于各方面的需求而不斷增加、擴(kuò)增效率此時(shí)也會(huì)同步提高；②反應(yīng)條件在各種應(yīng)用環(huán)境下會(huì)得以優(yōu)化，擴(kuò)增效率在不斷提升的同時(shí)，檢出限出現(xiàn)降低趨勢(shì)；③與其他形式的分子生物學(xué)技術(shù)能夠進(jìn)行結(jié)合使用，檢測(cè)特異性、靈敏度以及范圍得以提高[5]。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，本文對(duì)多重PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用與展望進(jìn)行了探討與論述，可觀察出該項(xiàng)技術(shù)相比于一般PCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)所在。因此需給予多重PCR技術(shù)足夠的重視，探索其更多的發(fā)展空間與發(fā)展?jié)摿?，使其能夠在最?yōu)環(huán)境下實(shí)現(xiàn)充分的利用，從而高效率、高質(zhì)量地完成系列檢測(cè)任務(wù)，并較大程度的降低檢測(cè) 成本。