重定位策略在罕見病治療藥物中的應用研究進展

任淑月,孫嵐,杜冠華

(1. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所,北京 100050； 2. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京 100021)

世界衛(wèi)生組織(WHO)定義導致總人口0.65‰～1‰人群患病的疾病為罕見病[1]。盡管這個比例很低但疾病總數已高達8 000種，全球受罕見病影響的人數高達3.5億[2-3]。很多罕見病在生命早期發(fā)生，約有30%罕見病兒童在5歲前死亡，甚至約35%的罕見病嬰兒在出生后第一年死亡[4]。

罕見病的治療藥物稱之為孤兒藥。大部分的罕見病與遺傳及基因突變有關[5]，其病理生理、病因及疾病的歷史演變未知等因素影響孤兒藥的研發(fā)進程。考慮到罕見病人數少及患者地理分布散落、臨床樣本稀缺[6]、藥物的研發(fā)周期長(13～15年)、費用高(20～30億美元)、成功率低(10%)、收益甚微等諸多因素[7]，很多醫(yī)藥企業(yè)對孤兒藥的研發(fā)望而卻步。為解決這一現狀與罕見病臨床用藥迫切需求之間的矛盾，近年來各國均對罕見病的藥物研發(fā)實施積極鼓勵的政策，并特別成立了很多平臺來滿足科研需求。罕見病專家和倡導者Ségolène Aymé創(chuàng)建的Orphanet(孤兒病聯(lián)盟)旨在通過40多個國家的組織機構合作，提供關于罕見病高質量的數據及可靠的臨床指導[8]，以使研究者們共享信息，科學分析進而促進藥物研發(fā)。美國國立衛(wèi)生研究院遺傳與罕見病信息中心提供了罕見病及孤兒藥相關的綜合信息[9]，以及美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)發(fā)布的罕見病用藥現代化計劃，加快了積壓遺留的罕見病用藥資格認證[10]。在我國，2016年已啟動了國家罕見病注冊系統(tǒng)(national rare diseases registry system of China,NRDRS)建設罕見病臨床隊列研究項目，旨在闡述罕見病的臨床信息和組學信息，闡釋罕見病的發(fā)病機制，最大限度地為孤兒藥臨床試驗提供便利[11]。

目前罕見病的治療方法包括小分子藥物、單克隆抗體、蛋白質替代療法、寡核苷酸、基因和細胞療法以及藥物重定位(drug repositioning,DRP)[12]。近年來隨著計算機技術的發(fā)展，應用DRP策略研發(fā)孤兒藥獲得越來越多的研發(fā)人員青睞。DRP是一種發(fā)現現有藥物或宣布撤市化合物新適應證的方法[13-14]，這些藥物或化合物的藥代動力學特征及安全范圍已知，有些甚至已經進入臨床Ⅱ期或Ⅲ期試驗階段，因此其研發(fā)可以跨過藥物發(fā)現甚至臨床前階段，具有批準快(3～12年)、費用低(50%)、成功率高(30%)等特點[15-16]。重定位藥物開發(fā)上市一般需要三步：候選藥物的確定；藥物臨床前評價及作用機制研究；Ⅱ期臨床試驗評估療效，其中第一步在整個重定位研究中發(fā)揮至關重要的作用[17]。DRP已不是一個新的概念，目前DRP的策略轉化是從偶然發(fā)現已有藥物新適應證到系統(tǒng)、合理地尋找藥物的可能。常規(guī)疾病治療藥物用于罕見病治療大多數是基于臨床意外發(fā)現，這對8 000多種罕見病的藥物研發(fā)無疑是一個很大的障礙。計算機輔助藥物發(fā)現是一種比傳統(tǒng)藥物研發(fā)更便宜、更快速的方法，主要通過藥物靶點結合預測、計算機網絡分析及基因疾病信號分析等方面而實現，為孤兒藥研發(fā)提供了廣闊的前景[18]。本文綜述了三種DRP策略在孤兒藥研發(fā)中的應用，以期為后期藥物研發(fā)提供借鑒及思路。

基于DRP策略尋找孤兒藥得到越來越多研發(fā)者的關注，目前DRP的方法包括偶然或系統(tǒng)性臨床回顧分析發(fā)現已有藥物的不良反應、體外高通量篩選化合物以及計算機輔助藥物發(fā)現[19]。

1 偶然或系統(tǒng)性臨床回顧分析

偶然或系統(tǒng)性臨床回顧性分析是基于意外發(fā)現藥物新的適應證，雖然沒有經過理性設計，也未能闡明藥物在新適應證中的作用機制，但其促進了藥物重定位策略的推廣[20]。

肺動脈高壓是進行性肺血管重構導致右心室后負荷加重，進而造成右心衰竭的一種罕見病[21]。盡管目前全球批準治療肺動脈高壓的藥物有14種，但還不能實現提高生存率[22]、減少嚴重的不良反應及治療特異性等目標。面對新藥研發(fā)的高投入、長周期等特點以及肺動脈高壓藥物研發(fā)的困難，DRP有望為肺動脈高壓治療藥物研發(fā)提供新策略[17]。鈣通道阻滯劑(calcium channel blockers,CCBs)通過降低細胞內鈣離子水平而最早在高血壓患者中使用[23]，20世紀80年代，研究人員發(fā)現高劑量的CCBs可以提高肺動脈高壓患者的生存率，截至目前CCBs仍作為肺動脈高壓的有效治療藥物[24]。西地那非屬于5型磷酸二酯酶抑制劑，1991年已被批準用于治療心絞痛，但由于其與硝酸鹽及其他物質反應，后被終止使用。研究人員通過臨床回顧性分析發(fā)現西地那非可改善勃起功能障礙，于1998年批準其用于治療勃起障礙。進一步根據其對血管生物學的影響，發(fā)現西地那非還與肺循環(huán)有關，并于2005年批準其治療肺動脈高壓[25-26]。

普萘洛爾是由1988年獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎的詹姆斯·布萊克爵士開發(fā)用于治療心絞痛和高血壓的非選擇性β腎上腺能受體阻斷劑。大部分的小兒血管瘤是不需要治療而可以間斷性退化的，但10%～15%的增生性小兒血管瘤會引發(fā)威脅生命的并發(fā)癥，因此需要尋找治療方法以緩解患者病痛。而選擇普萘洛爾治療增生性小兒血管瘤是基于偶然發(fā)現的。Léauté-Labrèze等[27]使用糖皮質激素治療鼻腔毛細血管瘤時，患者出現梗阻性肥厚型心肌病等不良反應，應用普萘洛爾時偶然發(fā)現其可能在控制血流動力學及血管生成中產生重要作用，使得鼻腔毛細血管瘤變軟，顏色也隨之發(fā)生變化。經過大量臨床試驗研究最終通過美國FDA和歐洲藥品管理局的批準用于小兒血管瘤的治療[27]。

Hutchinson-Gilford早老綜合征(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)是一種極罕見的疾病，可引起組織快速衰老并伴隨嚴重的動脈粥樣硬化癥狀，進而導致患者6至20歲階段死亡，平均壽命為14.5歲[28]。HGPS的主要病理機制是LMNA基因突變導致早衰蛋白A表達異常進而引起對細胞核穩(wěn)態(tài)的毒性作用。前期用于治療癌癥的Lona-farnib是一類法尼基轉移酶抑制劑，其在一項臨床隨機試驗中表現出改善心血管及骨骼疾病方面的特性[29]，進一步經過2.2年的臨床試驗給予早衰患者每天2次服用150 mg Lonafarnib后，與未給藥組相比能明顯降低患者的死亡率[30]。

2 體外高通量篩選化合物

體外高通量篩選是一種通過對大量樣品和化合物的測定來發(fā)現藥物的方法，主要基于機器人技術、液體處理、高通量成像和數據分析等流程來實現，具有經濟、快速和便于推廣等特點。細胞是人類疾病的重要模型，具備大量繁殖培養(yǎng)、適用于遺傳分析等特征，將其作為體外高通量篩選的模型，可以提前確定藥物敏感性，擴大藥物覆蓋范圍和提高研發(fā)效率[31]。

胃腸道間質瘤(gastrointestinal stromal tumors,GISTs)是一種消化道間葉性惡性腫瘤，能夠生長于胃腸道的任何部位，胃和小腸較為常見，結直腸次之[32]。大約85%的GISTs是由血小板源性生長因子受體A (platelet-derived growth factor receptor A,PDGFRA)和酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor,TKR)C-kit突變引起的[33]。目前治療GISTs的標準方法仍是手術切除，但是存在術后復發(fā)率高的風險。Pessetto等[34]基于定量藥物篩選方法從796個FDA批準的藥物中，體外篩選出金諾芬和磷酸氟達拉濱，具有抑制GISTs細胞增殖的效應。活性氧的過量產生和抗氧化系統(tǒng)(如TrxR系統(tǒng)) 受損可能導致氧化應激，而氧化應激與包括癌癥在內的多種疾病的發(fā)病機制有關。研究人員進一步發(fā)現，1985年批準治療類風濕關節(jié)炎的金諾芬具有抑制TrxR酶活性并誘導活性氧生成，抑制GISTs細胞生長和降低生存活力的效應，這對GISTs的治療可能有很好的效果。

進行性骨化性纖維發(fā)育不良(fibrodysplasia ossificans progressiva,FOP)是一種全球患病率約為1/200萬的罕見病，超過95%的FOP是由骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(BMP)受體ACVR1/ALK2的反復突變(617G>A; R206H)引起的[35-36]。突變的受體引起Id1轉錄因子的上調。Yamamoto等[37]通過篩選1 040種FDA批準的藥物，尋找具有抑制ACVR1/ALK2突變小鼠的C2C12成肌細胞中Id1啟動子效應的化合物，最終確定馬來酸哌克昔林具有治療FOP的潛力。

3 計算機輔助藥物發(fā)現

當今，大量疾病的生物學數據正在不斷產生，如果我們單純基于臨床和傳統(tǒng)藥物重新定位方法發(fā)現藥物，則無法擴展和利用這些不斷增長的數據。因此，亟須準確而有效的計算方法來充分利用這些數據，以提出最有價值的線索，供研究者考慮，并使研究人員擺脫由于大量數據而引起的混亂[38]。

3.1 基于疾病-藥物信號網、通路分析

針對孤兒藥的研發(fā)，Brylinski等[39]建立了eRepo-ORP數據庫，旨在基于Drug Bank、PDB數據庫、Orphanet平臺以及eThread和eFindSite算法提取出31 142個潛在的罕見病治療藥物-靶點對，這在很大程度上為孤兒藥的研發(fā)明確了方向。為了尋找已知藥物的新結合靶標，Pulley等[3]開發(fā)了eMatchSite計算機程序。將eMatchSite程序和基于結構的虛擬篩選相結合，系統(tǒng)地模擬了已知藥物與980例罕見病相關蛋白的藥物-靶標復合物。Khaladkar等[40]利用2016年創(chuàng)建的Open targets平臺上已有全基因組信息，通過藥物靶點-疾病網絡發(fā)現820個已證實或潛在的藥物治療靶點具有2 540個新的適應證，這將促進已有藥物的重新定位。

腎上腺皮質癌是一種無有效治療方法的罕見病，盡管前期報道米托坦可治療腎上腺皮質癌，但其在患者群體中響應很低，因此尋找腎上腺皮質癌的治療方案迫在眉睫。Lotfi等[41]應用Heter-LP重定位方法根據藥物、疾病和靶點之間組成的異構網絡挖掘腎上腺皮質癌治療藥物。他們首先建立三個有關藥物、疾病和靶點的同構網絡和三個關于藥物-疾病、藥物-靶點和疾病-靶點的異構網絡。接下來進入DT-Hybrid投射階段，研究人員基于異構子網絡計算每個概念對應的拓撲相似度，并將這種拓撲相似性與同構子網絡相結合，最終應用標簽傳播算法使藥物、疾病和靶點之間產生新的預測聯(lián)系。他們通過上傳米托坦治療腎上腺皮質癌的靶點hsa:1584和 hsa:2230，從11 140種藥物中獲得has：1584-螺內酯和has：2230-黃素腺嘌呤二核苷酸藥物-靶點網絡，同時has：1584-螺內酯網絡得到了進一步確認；基于藥物-疾病網絡分析11 140個藥物，結果提示促皮質素具有治療腎上腺皮質癌的潛力；通過Heter-LP對疾病-靶點網絡深度分析，從5 568個可能靶點中篩選出hsa:3480(IGF-1R)、hsa:7153(TOP2A)、hsa:1717(DHCR7)、hsa:4157(MC1R)和hsa:4215(MAP3K3)5個更具有治療潛力的靶點。Heter-LP計算機重定位方法獲得的結果對腎上腺皮質癌的后期藥物研發(fā)提供了指導。

3.2 基于體外篩選聯(lián)合基因、疾病信號和全基因組關聯(lián)(GWAS)分析

大多數罕見病有遺傳病因，52 944種與罕見病相關的遺傳突變中單核苷酸突變、缺失和重復是最常見的突變類型[42]。研究者可以基于下一代基因測序技術(全基因組測序、全外顯子測序以及靶向測序)，比較罕見病患者與健康志愿者之間的差異基因，進而基于罕見病患者的差異基因組，利用生物信息學的方法來尋找治療藥物[43]。

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種罕見的、無法治愈的呼吸系統(tǒng)疾病，主要表現為肺組織壞死和瘢痕出現，一般于確診后2～5年死亡[44]。研究人員通過NCBI數據庫獲得健康和不同階段IPF患者人群的肺組織基因表達數據集，繼而通過R/Bioconductor package Limma和Netwalker數據分析軟件分別篩選出不同階段前150個上調基因和150個下調基因，并通過連通圖(connectivity map,CMap)、LINCS(library of integrated network-based cellular signatures)和Spiedw DRP工具分析以上兩個基因列表進而確定潛在治療藥物，進一步通過綜合藥物重定位打分重新排列潛在藥物。研究者從結構和生物學特性上比較這些藥物與FDA批準或潛在的治療IPF藥物之間的差異，并進一步尋找與這些重定位藥物結構相似的天然化合物，同時也對IPF相關的microRNA和重定位藥物相關的microRNA進行比較。結果顯示，氯硝柳胺在IPF各個階段都獲得高分，從結構相似性方面考慮，氯硝柳胺與其他的IPF潛在抑制劑結構相似，并綜合考慮安全性等問題后，其被推薦進入臨床研究階段治療IPF。同樣，結果提示茴香霉素和嘌呤霉素也有治療IPF的潛力。尼達布尼已被FDA批準治療IPF，研究人員基于microRNA比較研究發(fā)現hsa-miR-25-3p 和 hsa-miR-208a-5p具有抑制尼達布尼的治療靶點作用，因此這也提供了一種新的基于microRNA尋找治療IPF的方法[45]。

努南和豹斑綜合征(Noonan and Leopard syndromes,NS和LS)是一組具有重疊表型特征的常染色體顯性遺傳病，存在多器官和系統(tǒng)異常的特征，包括心肌肥厚、短身材、胸部畸形和面部畸形等[46]。盡管目前還沒有批準的治療藥物，但是前期的研究發(fā)現PTPN11基因的錯義突變分別與50%的NS和70%的LS有關[47]。研究人員通過人為誘導NS 和 LS患者的多功能干細胞獲得轉錄組，以轉錄組為紐帶，基于CMap連通圖和L1000技術，根據疾病和藥物相對的轉錄組是否匹配最終找到61個潛在治療NS的化合物和43個治療LS的化合物[48]。這為NS和LS的治療藥物研發(fā)明確了方向。

4 討論與總結

大多數重定位的藥物藥代動力學及安全劑量已知，但是在不同的疾病或病理條件下可能會表現出不同的藥代動力學參數，甚至導致沒有治療效果。惡性胸膜間皮瘤是一種原發(fā)于胸膜、侵襲性高、極少見的惡性腫瘤[49]，沒有標準的治療方法。惡性胸膜間皮瘤的潛伏期約為40年，一旦確診，未經治療的預期壽命不到12個月[50]。目前應用重定位策略尋找治療惡性胸膜間皮瘤的潛在藥物多達11類，大量藥物只在體外或動物體內進行驗證，只有丙戊酸[51]，沙利度胺[52-53]和唑來膦酸[54]三者進入臨床評估，沒有表現出顯著的治療效果。用于皮膚過敏或過敏性鼻炎的H1-抗組胺藥物Latrepirdine具有神經保護和增強認知的效果，將其重定位至亨廷頓式病中，盡管動物模型中顯示出治療效果，但在Ⅲ期臨床試驗中因沒有療效而宣布失敗[55]。頭孢曲松重定位在肌萎縮側索硬化癥的臨床Ⅰ/Ⅱ期表現出很好的前景，但是Ⅲ期試驗仍以失敗告終[56]。新生兒先天性高胰島素血癥(congenital hyperinsulinism，CHI)是引起新生兒持續(xù)低血糖的主要原因，會導致嬰兒腦損傷、發(fā)育遲緩或學習障礙[57]。氯噻嗪和生長抑素類似物奧曲肽在治療CHI時會有脫靶效應并產生不良反應。而高胰島素血癥和β細胞增生的可能機制涉及雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)途徑的組成性激活，前期的文獻報道m(xù)TOR的抑制劑—西羅莫司對氯噻嗪和生長抑素類似物耐受的患者有治療效果[58]，進一步基于4例患者的基因表達譜發(fā)現，雷帕霉素具有抑制β細胞擴張和增殖的效果[59]，為了推廣雷帕霉素的使用，研究人員增大患者數量至10人[60]，發(fā)現雷帕霉素產生的效果并沒有氯噻嗪和奧曲肽的明顯，甚至會產生嚴重的不良反應，導致雷帕霉素治療CHI的研究不得不宣布停止。因此，基于DRP策略研發(fā)孤兒藥時，在應用新技術新方法的同時，還應充分考慮臨床病理的復雜性而謹慎地做出全面評估。

盡管應用DRP策略研發(fā)孤兒藥存在失敗的風險，但相比一個全新的實體藥物研發(fā)過程，DRP已經很大程度上縮短了研發(fā)周期，提高了研發(fā)效率，仍然是一個很有前途的領域，尤其在基于計算機輔助DRP方面受到越來越多研發(fā)人員的關注。此外，目前DRP在孤兒藥研發(fā)中受到的一些阻礙并不是不能克服，需要各部門聯(lián)合進一步指導和支持，爭取早日通過DRP策略突破孤兒藥研發(fā)的瓶頸。