納米材料改善腫瘤缺氧增強(qiáng)聲動力療效的研究進(jìn)展

黃碧英（綜述）牛誠誠（審校）

聲動力療法（sonodynamic treatment，SDT）是一種由光動力學(xué)療法（photodynamic treatment，PDT）發(fā)展而來的新興、無創(chuàng)的治療方法，由于具有更深的輻射距離且無光毒性特點(diǎn)逐漸替代傳統(tǒng)的PDT。目前被廣為認(rèn)可的SDT機(jī)制是：當(dāng)聲敏劑接受低強(qiáng)度的超聲輻照時，利用超聲波在液體介質(zhì)發(fā)生的空化效應(yīng)，將能量傳遞給周圍的氧氣產(chǎn)生毒性活性氧（reactive oxygen species，ROS）。但是腫瘤長期處于缺氧微環(huán)境中，極大限制了SDT療效及進(jìn)一步臨床轉(zhuǎn)化。目前臨床上尚無針對此問題的抗癌藥物。納米材料不僅具有靶向性好、載藥量高，還可優(yōu)化腫瘤的靶向治療及增強(qiáng)影像，被廣泛用于藥物的載體［1］。如何利用納米醫(yī)學(xué)策略調(diào)節(jié)缺氧狀況，以改善SDT治療效果成為研究熱點(diǎn)。本文就SDT的作用機(jī)制，以及納米材料改善腫瘤缺氧從而增強(qiáng)SDT的研究進(jìn)展綜述如下。

一、SDT的機(jī)制

PDT是激光、光敏劑和氧氣三者間動態(tài)相互作用的過程［2］。SDT是從PDT發(fā)展而來，該過程中產(chǎn)生的ROS仍未得到充分的認(rèn)識，其機(jī)制尚不明確。目前較為認(rèn)可的機(jī)制是聲空化效應(yīng)在ROS的產(chǎn)生過程中起到重要的作用。超聲波與液體的相互作用會產(chǎn)生一種特殊的現(xiàn)象稱為聲空化，它可以激活聲敏劑并生成ROS［3］，空化可以分為穩(wěn)定空化和慣性空化，穩(wěn)定空化中氣泡震蕩，同時慣性空化過程中的氣泡增長到接近共振的大小，并在劇烈塌陷之前膨脹至最大，由內(nèi)爆引起的釋放能量所產(chǎn)生的環(huán)境被視為聲化學(xué)反應(yīng)器。在組織化學(xué)反應(yīng)器的作用下，一小部分聲敏劑將被從基態(tài)激活為激發(fā)態(tài)，且隨著被激活的聲敏劑返回基態(tài)，釋放出的能量可以轉(zhuǎn)移到周圍的環(huán)境氧中，產(chǎn)生大量的ROS，隨后介導(dǎo)細(xì)胞毒性。這一過程與PDT中ROS產(chǎn)生的原理相似。慣性空化中，當(dāng)微氣泡爆炸時，釋放出的能量可引發(fā)聲致發(fā)光的發(fā)射［4-5］，且在超聲的空化效應(yīng)中，微氣泡破裂瞬間釋放出的能量與周圍的液體作用發(fā)生熱解作用，進(jìn)一步增強(qiáng)了殺傷細(xì)胞的能力。微氣泡內(nèi)爆發(fā)釋放的能量還可通過流體動力、剪切力破壞細(xì)胞，如破壞細(xì)胞的重要細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。總之，SDT作用過程需要具備超聲輻照、聲敏劑、氧氣3個條件，且聲空化效應(yīng)在ROS的產(chǎn)生起著重要作用。

二、納米材料改善腫瘤缺氧增強(qiáng)SDT的研究進(jìn)展

腫瘤缺氧是由氧氣供應(yīng)與消耗間的不平衡引起的，其對癌癥的生長、轉(zhuǎn)移具有至關(guān)重要的影響，長期以來一直被認(rèn)為是癌癥治療的主要障礙。新興的概念之一是在腫瘤部位供應(yīng)或產(chǎn)生氧氣，以增加部分氧氣壓力，從而逆轉(zhuǎn)缺氧及其影響。McEwan等［6］通過將聲敏劑玫瑰紅附著在脂質(zhì)穩(wěn)定化的充氧微氣泡的表面上，該合成物可較相同濃度的單獨(dú)敏化劑產(chǎn)生更多的ROS，超聲治療后，該治療組的腫瘤鼠在治療后5 d腫瘤體積縮小了45%，結(jié)果表明，采用將氧氣輸送至缺氧腫瘤的方法可以顯著增強(qiáng)SDT。但是，1 ml的氧氣微泡的攜氧量僅為2 mol左右，同時受到保存期短、易相變等的限制，不易向臨床轉(zhuǎn)化。因此，納米醫(yī)學(xué)提出了新的策略，納米材料在緩解缺氧微環(huán)境的兩種主要策略：①將氧氣直接輸送到腫瘤中；②通過不同的方法在腫瘤微環(huán)境中原位產(chǎn)生氧氣。

（一）基于全氟化碳材料輸送氧氣

全氟碳化合物（PFC）是基于烴的合成有機(jī)分子，其中氫原子部分或完全被氟原子取代，氟的高電子負(fù)電性使PFC具有出色的氧親和力［7］。許多PFC化合物已被臨床批準(zhǔn)用于各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括超聲、熒光、MRI檢查和血液取代基［8］。為更好地利用PFC攜帶氧氣的特點(diǎn)，研究者采用了一種將光敏劑/聲敏劑和PFC納米乳劑一起負(fù)載的新方案。Chen等［9］制備碳氟鏈修飾的負(fù)載IR780的介孔有機(jī)硅納米粒，該有機(jī)硅納米粒有著優(yōu)異的生物相容性和較大的表面積特點(diǎn)，其不僅與氧氣有著較強(qiáng)的親和力，且更易被負(fù)載于載體上；經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)納米粒合并超聲輻照的PANC-1細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯低于對照組，超聲輻照后細(xì)胞內(nèi)的氧氣濃度可在2 h內(nèi)迅速增長至15 mg/ml，說明該納米粒在超聲的激發(fā)下可迅速升高腫瘤細(xì)胞內(nèi)氧氣水平。采用電子自旋共振光譜進(jìn)一步可視化評估ROS產(chǎn)量，經(jīng)超聲輻照處理所得的ROS信號明顯增加，說明該納米粒釋放的氧氣可用于增強(qiáng)SDT產(chǎn)生更多的ROS。在缺氧胰腺癌移植瘤小鼠模型中，經(jīng)不同處理30 d后，該納米粒經(jīng)超聲輻照后小鼠腫瘤體積顯著減小，腫瘤體積是未攜帶氧氣納米粒組的1/4。該實(shí)驗(yàn)表明充足的氧氣供應(yīng)可產(chǎn)生更多的ROS，最終實(shí)現(xiàn)了針對低氧PANC-1胰腺癌的高效SDT治療效果。

由于腫瘤的異質(zhì)性、耐藥性或頻繁復(fù)發(fā)，目前依靠單一療法的癌癥治療仍然不能令人滿意。聯(lián)合治療可將具有不同藥物和/或機(jī)制組合以協(xié)同提高治療效果。Huang等［10］構(gòu)建了一個攜氧納米平臺用于SDT和化療的聯(lián)合治療，采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物作為該納米粒的外殼，將具有攜氧作用的全氟三丁胺作為內(nèi)核，并通過化學(xué)方法載入聲敏劑IR780和化療藥物阿霉素。在小鼠乳腺癌移植瘤模型中，化療組小鼠腫瘤體積較原始增加4.2倍，而經(jīng)過每隔2 d行瘤內(nèi)注射該納米粒且行超聲輻照治療后，小鼠腫瘤體積僅為原始體積的2倍，說明該攜氧納米粒能有效抑制腫瘤的生長，改善腫瘤微環(huán)境缺氧同時增強(qiáng)SDT和化療的聯(lián)合治療。因此，克服缺氧不僅能提高SDT療效，在與傳統(tǒng)抗癌治療的聯(lián)合治療中也將發(fā)揮重要作用。

（二）基于紅細(xì)胞仿生納米材料輸送氧氣

人造材料通常會觸發(fā)人體免疫防御系統(tǒng)的免疫反應(yīng)，因此在體內(nèi)應(yīng)用時需嚴(yán)格的要求。受長循環(huán)、良好的生物相容性和生物膜免疫原性低的啟發(fā)［11］，各學(xué)者［12-14］采用取自紅細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、血小板的膜構(gòu)建仿生納米載體。其中，紅細(xì)胞缺乏細(xì)胞核和細(xì)胞器，但富含血紅蛋白（每個紅細(xì)胞攜帶2.7億個血紅蛋白分子），在循環(huán)過程中容易發(fā)生自氧化作用，產(chǎn)生的有毒物質(zhì)Ferryl-Hb。Du等［15］制備了基于紅細(xì)胞仿生納米載體，利用Ferryl-Hb的毒性增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。紅細(xì)胞具有由特殊酶（如過氧化氫酶）組成的系統(tǒng)［16］，過氧化氫酶可以催化腫瘤環(huán)境中的過氧化氫（H2O2）產(chǎn)生氧氣。基于此，Li等［17］利用低滲法制備紅細(xì)胞膜囊泡，將聲敏劑與紅細(xì)胞膜囊泡超聲混合，緊接著通過聚碳酸酯膜擠出可得到經(jīng)紅細(xì)胞膜包被的供氧仿生納米探針（平均粒徑為141 nm）。為了驗(yàn)證紅細(xì)胞膜囊泡中特殊酶催化產(chǎn)生氧氣的能力，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該納米材料對應(yīng)的綠色免疫熒光強(qiáng)度最弱，說明腫瘤中H2O2被納米探針攜帶的過氧化氫酶催化后，釋放氧氣進(jìn)一步緩解腫瘤缺氧；體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在口服抗腫瘤藥異硫氰酸苯乙酯的輔助下，該納米探針可以有效消除腫瘤并延長小鼠的生存時間。這種新穎的納米平臺為改善深部腫瘤的治療提供了新方法。

（三）基于內(nèi)源性H2O2產(chǎn)生氧氣

腫瘤環(huán)境中異常的增殖代謝和調(diào)節(jié)功能障礙導(dǎo)致大量的H2O2的產(chǎn)生，可將其用于原位產(chǎn)生氧氣代以克服缺氧。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了幾種不同方法以利用內(nèi)源性H2O2進(jìn)行低氧緩解從而增強(qiáng)SDT。

1.基于過氧化氫酶樣供氧：過氧化氫酶是體內(nèi)主要的抗氧化酶，可將H2O2轉(zhuǎn)化為水和氧氣。Li等［18］制備一種氟化殼聚糖合成為高效無毒的透黏膜遞送載體，與內(nèi)消旋四（4-羧苯基）卟啉偶聯(lián)的過氧化氫酶組裝在一起。將不同濃度過氧化氫酶的該納米粒加入等體積的H2O2中，與不含過氧化氫酶組比較，含過氧化氫酶組可產(chǎn)生大量的氧氣，說明該納米粒可催化H2O2產(chǎn)生氧氣；且隨著納米粒中過氧化氫酶濃度越高，測得氧氣含量也越高。經(jīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，滴注該納米粒的小鼠腫瘤的氧合水平顯著提高，而不含過氧化氫酶的納米粒治療則無效果。因此，利用過氧化氫酶催化的腫瘤內(nèi)源性H2O2產(chǎn)生的氧氣來有效緩解腫瘤組織中的缺氧，能進(jìn)一步改善SDT的功效。

2.基于納米酶供氧：納米酶是指具有酶樣催化特性的納米材料，由于其獨(dú)特的特性，如易于合成、高穩(wěn)定性成為近期研究重點(diǎn)。具備納米酶樣活性的材料有：二氧化錳（MnO2）、普魯士藍(lán)（PB）、鉑（Pt）、高鐵酸鉀鹽（VI）（K2FeO4）等。

（1）MnO2：Zhang等［19］利用MnO2為納米載體，包封了聲敏劑血卟啉單甲醚和葡萄糖氧化酶用以介導(dǎo)SDT/饑餓療法聯(lián)合治療。MnO2納米粒催化H2O2降解以產(chǎn)生氧氣的方式與過氧化氫酶一致，不僅將其提供給葡萄糖耗竭反應(yīng)用于有效的饑餓療法，而且還增強(qiáng)了ROS的生成，以促進(jìn)血卟啉單甲醚介導(dǎo)的SDT效應(yīng)。此外，系統(tǒng)中釋放的Mn2+離子能夠增強(qiáng)MRI信號。為在影像介導(dǎo)下的精確靶向治療提供了新的方法。

（2）K2FeO4：是一種高級氧化物，對水和H2O2具有高反應(yīng)性同時能消耗腫瘤微環(huán)境中的谷胱甘肽，表現(xiàn)出過氧化氫酶樣性質(zhì)。Fu等［20］利用可生物降解的中空多孔有機(jī)硅納米材料作為納米載體，同時載入聲敏劑原卟啉和K2FeO4。體外實(shí)驗(yàn)研究觀察到氧氣含量在4 min內(nèi)明顯增加至8.9 mg/L；且采用等價的納米載體加入含H2O2的PBS中，氧氣含量可升高至約12.0 mg/L。利用光聲成像觀察體內(nèi)腫瘤位置的氧合情況，結(jié)果與體外一致。該納米載體經(jīng)超聲輻照40 min內(nèi)，腫瘤內(nèi)的超聲信號明顯增強(qiáng)，且氧合血紅蛋白飽和度從32.3%顯著增加至52.7%；在為期15 d的抑瘤實(shí)驗(yàn)中，治療組小鼠移植骨肉瘤的抑瘤率高達(dá)94.9%，說明該納米系統(tǒng)改善缺氧增強(qiáng)SDT的策略有著應(yīng)用前景。

（3）Pt納米顆粒：其是許多化學(xué)反應(yīng)的知名催化劑，具有過氧化氫酶樣活性。Liang等［21］制備了一種用以聲動力聯(lián)合化療/光熱的多功能納米載體，即氫化的空心含鉑二氧化鈦顆粒包封化療藥物阿霉素。氫化的二氧化鈦表面上不均勻分布的鉑納米顆粒不僅促進(jìn)了電子轉(zhuǎn)移，且還可發(fā)揮過氧化氫酶樣活性，在低氧環(huán)境中產(chǎn)生足夠的氧氣。在濃度為250×10-6M的H2O2溶液中，短短50 s內(nèi)，該納米載體催化產(chǎn)生氧氣可達(dá)到5.5 mg/ml，證實(shí)其能高效催化H2O2提供氧氣。

（4）PB：具有出色的過氧化氫酶活性，催化腫瘤區(qū)域H2O2產(chǎn)生氧氣。Zhang等［22］制備一種經(jīng)低分子量透明質(zhì)酸表面修飾的介孔PB且包封聲敏劑血卟啉單甲醚的多功能納米系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)該納米系統(tǒng)可作為原位巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化器和氧氣發(fā)生器。利用動物超聲成像系統(tǒng)監(jiān)測腫瘤區(qū)域中氧氣水平發(fā)現(xiàn)在靜脈注射該納米系統(tǒng)2 h后，腫瘤中出現(xiàn)了明顯的超聲信號，表明腫瘤組織中存在大量的氧氣，實(shí)現(xiàn)了可視化監(jiān)測體內(nèi)氧氣水平；此外，免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過該納米系統(tǒng)治療10 d后，小鼠腫瘤區(qū)域的缺氧熒光減弱，表明腫瘤區(qū)域缺氧得到很大的改善。

三、總結(jié)及展望

總之，基于納米材料改善腫瘤缺氧是一種有效的、新興的策略，但是在向臨床的應(yīng)用轉(zhuǎn)化中，存在著不少棘手的問題：①癌癥納米醫(yī)學(xué)適用性的主要機(jī)制是由于腫瘤的EPR被動靶向效應(yīng)，但有些納米材料并未大量聚積于腫瘤區(qū)域［23］；②納米材料尚處于研究階段，目前多采用金屬（如錳、鐵、銅等）的納米粒提供氧氣，但這些物質(zhì)在正常情況下非特異性地積累于組織并緩慢釋放金屬離子可能有害；如聚積在其他健康的部位，也會引起臟器的高氧毒性等相關(guān)問題，后期需進(jìn)行長期毒性實(shí)驗(yàn)（至少6個月），以評估其生物相容性和安全；③大多缺氧癌細(xì)胞均位于實(shí)體瘤深處，遠(yuǎn)離血管，對于納米材料而言，進(jìn)入這些細(xì)胞具有極大的挑戰(zhàn)性。因此，尋找合成方法簡單、毒性低、供氧強(qiáng)、具有深層腫瘤滲透能力的納米粒仍是未來研究的熱點(diǎn)。