外泌體在胰腺腫瘤早期診斷、治療和預后方面的臨床價值

夏文雯 陳瑋 王強 趙嚴

1同濟大學附屬第十人民醫院消化內科，上海 200072；2張家港市第二人民醫院消化內科，張家港 215600

外泌體(exosomes)是一種40～100 nm大小，含有DNA、RNA和蛋白質的細胞外囊泡，在腫瘤的生長和遷移中發揮著重要作用。所有活細胞都會產生外泌體，而癌細胞產生的外泌體較正常細胞更多。外泌體的脂質雙層膜可以保護內部的核酸，使其免被血漿中的核酸酶分解，使內部核酸能以高分子量形式存在，這些高質量DNA材料使分子分析具有更高的分辨率和敏感性[1]。體液檢測腫瘤外泌體的簡便性大大推動了外泌體在癌癥診斷效用方面的研究。部分研究表明外泌體不僅可以幫助診斷疾病，還與治療的反應及疾病預后相關。

1．外泌體核酸與胰腺腫瘤早期診斷：外泌體中含有高質量的核酸，通過核酸來早期診斷胰腺癌是近幾年的研究熱點。Madhavan等[2]研究發現，血清外泌體上癌癥起始細胞標記和miRNA標記的互補性增強了基于血清外泌體的胰腺癌診斷的可靠性，并且證實了這種檢測手段在大規模臨床評估上的穩定性。Goto等[3]通過下一代測序分析評估了胰腺癌或導管內乳頭狀黏液性腫瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN)患者和沒有腫瘤患者的外泌體miRNA(ex-miRNA)的表達，發現與對照組相比，胰腺癌和IPMN患者中ex-miR-191、ex-miR-21和ex-miR-451a的表達顯著上調，且這3種ex-miR的診斷準確性比血清miRNA高5%～20%。Kitagawa等[4]也發現血漿中部分信使RNA和小核仁RNA，如WASF2、ARF6、SNORA74A和SNORA25被包裹在外泌體中并從培養的胰腺癌細胞中分泌，且WASF2水平與胰腺癌風險的相關性最高，可用于胰腺癌的早期診斷。Nakamura等[5]研究了PDAC和CP患者胰液中提取的外泌體，發現與CP患者相比，PDAC患者中ex-miR-21和ex-miR-155的相對水平明顯更高，而胰液miR-21和miR-155的相對水平差異無統計學意義，證明胰液中的部分外泌體miRNA，如ex-miR-21和ex-miR-155也可作為PDAC的生物標志物。

KRAS基因突變在胰腺癌患者中常見，其可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。Allenson等[6]發現KRAS突變體陽性與胰腺癌相關，而檢測外泌體DNA中的突變型KRAS比檢測血漿循環DNA具有更高的效用。

2．外泌體蛋白質與胰腺腫瘤早期診斷：外泌體中蛋白質的差異性表達也是胰腺癌早期診斷標志物的研究熱點。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(glypican 1, GPC1)在PDAC細胞和鄰近的基質成纖維細胞中表達。有研究表明正常胰腺和PDAC組織之間的GPC1水平差異無統計學意義，但PDAC患者的循環外泌體(circulating exosomes, crExos)中GPC1水平較高[1]，提示外泌體中的GPC1蛋白可用于PDAC的早期檢測。Melo等[7]通過研究乳腺癌、PDAC和健康供體患者血清中分離的crExos，發現GPC1陽性表達患者的crExos與癌癥之間存在強烈的相關性，特別是對于PDAC。進一步研究發現在胰腺癌患者血清crExos中檢測到GPC1，對診斷胰腺癌具有極高的特異度和靈敏度，可將健康受試者和良性胰腺疾病患者與早期及晚期胰腺癌患者區分開來。研究認為GPC1陽性表達者的crExos可作為潛在的非侵入性診斷和篩查工具，用于檢測早期階段的胰腺癌。之后的研究同樣發現GPC1蛋白在正常胰腺的外分泌部中不存在，但在PDAC中顯著過表達，同時腫瘤細胞中GPC1的增加與AJCC分期無關，表明它可能是早期PDAC的優良檢測標志物[8]。

除了GPC1蛋白，鋅轉運蛋白ZIP4同樣可用于PDAC的檢測。Jin等[9]發現外泌體ZIP4水平可用于區分惡性胰腺癌患者與良性胰腺疾病患者、膽道疾病患者和健康群體，良性胰腺腫瘤患者和胰腺炎患者的外泌體ZIP4水平也存在顯著差異。

1．外泌體與抗藥性：胰腺癌具有局部侵襲、早期轉移和對治療的高度抗性的特征，目前常規使用細胞毒性藥物來治療，吉西他濱是最常使用的藥物。抗藥性是治療失敗的主要原因，因此迫切需要有效的預測標志物以區分胰腺腫瘤患者并制定個體化治療方案，從而實現最小化治療抗性[10]。

Patel等[11]發現吉西他濱處理的胰腺腫瘤細胞能產生明顯的抗藥性，而這種抗藥性大多是由腫瘤細胞的外泌體引起。進一步研究發現這類經吉西他濱處理的釋放外泌體(gem-exo)的胰腺腫瘤細胞中超氧化物歧化酶2(superoxide demutase 2, SOD2)和ROS解毒基因(CAT)上調，而吉西他濱代謝基因脫氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase, DCK)下調。SOD/CAT上調抑制基礎和吉西他濱誘導的ROS產生，并部分促進化學抗性。外泌體遞送的miR-155導致DCK下調，而當miR-155的功能受到抑制或DCK得以恢復時，gem-exo介導的化學抗性顯著消除。這些發現證明了外泌體在介導胰腺腫瘤的獲得性化學抗性中的新作用。同一時期，Mikamori等[12]進一步驗證了吉西他濱的長期暴露會增加PDAC細胞中miR-155的表達，miR-155的增加誘導了外泌體的分泌，而外泌體將miR-155遞送到其他PDAC細胞，miR-155又可通過促進抗凋亡活性來增強PDAC細胞的化學抵抗能力。對miR-155或外泌體分泌的靶向治療可有效地減弱PDAC細胞的化學抗性，為吉西他濱治療PDAC提供了新的靶點。

Fan等[10]研究了對吉西他濱抗性可變的3種胰腺腫瘤細胞系(PANC1、MIA PaCa-2和BxPC3)分離出的外泌體在這些細胞系中傳遞化學抗性的能力，發現具有化學抗性的PANC1細胞外泌體促進了MIA PaCa-2和BxPC3細胞產生吉西他濱抗性。進一步研究表明，外泌體EphA2的表達可以傳遞抗藥性，這可能作為預測胰腺腫瘤治療反應的微創生物標志物。

2．外泌體與藥物遞送：除了化學抗性，藥物遞送方式的低效率也是限制現有藥物治療功效的一個重要因素。Pascucci等[13]在2014年首次證明間充質基質細胞能夠通過其分泌的膜微泡包裝和遞送活性藥物，為抑制體外腫瘤生長提供了一種新的藥物輸送方法。外泌體作為無免疫原性的納米級囊泡，在有效藥物遞送系統研究方面受到了極大的關注。Kanchanapally等[14]通過用阿霉素孵育胰腺癌細胞、胰腺星狀細胞和巨噬細胞來實現外泌體的藥物裝載，用高效液相色譜分析法評估藥物包裝到外泌體中的功效，發現胰腺癌細胞釋放的外泌體最高，且裝載藥物量也最多；而巨噬細胞衍生的外泌體顯示出最高的抗腫瘤活性，提示外泌體的藥物裝載存在供體細胞特異性差異，這可能影響它們作為治療性藥物載體的效用。

1．外泌體核酸與胰腺腫瘤患者預后：Takahasi等[15]研究發現血漿外泌體miR-451a在術后復發的PDACⅡ期患者中上升最明顯，且外泌體miR-451a與腫瘤大小和分期顯著相關。高水平外泌體miR-451a患者的總存活率和無病存活率顯著低于低水平miR-451a患者，認為血漿外泌體miR-451a水平可能是用于預測PDAC患者的復發和預后的有效微創生物標志物。但Goto等[3]卻發現高ex-miR-21表達患者的總存活率明顯短于低ex-miR-21表達患者，而ex-miR-191和ex-miR-451a不影響胰腺腫瘤患者的生存率。Li等[16]發現PDAC患者血漿外泌體miR-222高，與腫瘤大小和TNM分期顯著相關，是PDAC患者生存的獨立危險因素。而任瀟凡和李志花[17]在研究中發現高表達的外泌體lncRNA CCAT1與胰腺癌的進展有潛在的聯系，外泌體lncRNA CCAT1過表達與胰腺癌患者不良預后呈正相關，是影響胰腺癌患者不良預后的獨立因素。

研究證明KRAS突變也與胰腺腫瘤的預后有關。Bernard等[18]收集了患者的液體活檢樣本，通過多變量分析發現外泌體來源的DNA(exoDNA)中KRAS的突變等位基因分數(mutant allele fraction, MAF)≥5%是無進展生存期和總生存期的重要預測因子。進一步分析了局限性PDAC患者的連續血液樣品中exoDNA和循環腫瘤DNA(ctDNA)水平，發現新輔助治療后exoDNA水平的增加與疾病進展顯著相關，而ctDNA與預后無明顯相關性。Allenson等[6]也發現超過1%的KRAS MAF是影響無病生存期的重要風險因素。

2．外泌體蛋白質與胰腺腫瘤患者預后：Melo等[7]通過評估術前和術后血清GPC1陽性表達的PDAC患者crExos水平，發現手術切除后crExos水平顯著降低，進一步研究發現crExos水平與腫瘤負荷及手術前和手術后患者的存活相關，crExos的減少可作為預測疾病存活的獨立特異性預后標志。Frampton等[1]發現PDAC手術切除后患者crExos的GPC1水平顯著下降，且高crExos GPC1水平的患者具有更大的腫瘤負荷。Lu等[8]也發現GPC1是胰腺癌患者總生存率較低的重要危險因素，風險比增加1.82倍。在胰腺腫瘤發生過程中，GPC1異位表達并作為獨立的不良預后因素。高水平的GPC1與較差的病理分化和較差的生物學行為相關。然而，Tanaka等[19]的研究結果卻并未表明GPC1陽性病例與GPC1陰性病例之間的預后差異。考慮到GPC1是由胰腺癌前病變表達的，可能不參與胰腺癌晚期的惡性潛能，故認為GPC1蛋白表達與胰腺癌患者的總體存活率或無復發存活率無關。除GPC1，Sakaue等[20]還發現腹水提取的外泌體中高度糖基化的CD133可作為晚期胰腺癌患者預后較好的潛在生物標志物。

近幾年外泌體在胰腺腫瘤發生、發展、抗藥性、臨床診斷及預后的研究中備受關注，外泌體中的高質量核酸與蛋白質更是研究熱點。然而外泌體中低濃度的DNA和DNA突變影響了液體活檢的靈敏度，缺乏區分癌癥外泌體和正常外泌體的有效手段影響了液體活檢的特異度，這個問題的解決還有待外泌體DNA分離技術的改進。GPC1蛋白的表達在胰腺癌早期檢測方面也受到一定的限制，GPC1過表達的PDAC前體病變并不一定會發展成為胰腺癌，故確定GPC1表達水平的閾值以檢測胰腺惡性腫瘤十分必要。綜上所述，外泌體在胰腺腫瘤診治方面具有巨大發展潛力，為胰腺腫瘤提供了新的診療思路和手段，但后續仍需大樣本的研究進一步驗證。

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