生物3D打印用絲素蛋白基凝膠墨水的研究進展

姜雨淋， 王 卉， 張克勤

(1. 蘇州大學 紡織與服裝工程學院， 江蘇 蘇州 215021； 2. 蘇州大學 現代絲綢國家工程實驗室，江蘇 蘇州 215123； 3. 蘇州大學 紡織行業絲綢功能材料與技術重點實驗室， 江蘇 蘇州 215123)

蠶絲纖維因其柔軟的手感、珍珠般的光澤及良好的吸濕性,在傳統紡織領域使用已超過4 000年[1]。由于在蠶體內的自然成形過程中絲蛋白形成了準有序的液晶相，在后續吐絲過程中絲蛋白形成有序和無序相間結構，使蠶絲纖維表現出出色的力學性能，如強度、韌性。此外，蠶絲與生物體相互作用良好，產生免疫反應的概率極低，已被用作手術縫合材料近百年[2]。蠶絲纖維在傳統紡織領域可以通過機織、針織和非織造等工藝制作成面料，而近年來蠶絲經脫膠工藝去除表面絲膠蛋白成分后所獲得的再生絲素蛋白溶液，為制造具有多種形態結構的絲素蛋白(SF)材料提供了新的路徑。然而，受到傳統制造技術的限制，再生絲素蛋白材料的形態結構比較有限，難以呈現與天然組織類似的復雜精妙的多尺度、多層級結構，因此對調控細胞行為以及再生結構和功能化的組織作用有限，限制了其在生物醫學領域的進一步應用。

3D打印技術是一種新興的快速成形技術，相比于傳統的制造方法，3D打印技術可精確快速地制造任意復雜形狀的三維結構體，真正意義上地實現“自由制造”[3]。3D打印技術的獨特優勢使其在生物醫療領域發展迅速，可實現在體外重建具有特殊復雜三維結構和功能的類組織生物體系，為組織工程、再生醫學、器官移植、藥物篩選以及腫瘤研究等帶來新的研究思路與解決方案[4]。然而目前阻礙3D打印技術應用于生物醫學領域的一大挑戰是研究開發適用的生物墨水。SF由于其優異的生物相容性、可調節的生物降解性、卓越的可加工性以及成熟的養蠶行業可提供充足原料等優點而被廣泛用作生物材料，這為生物3D打印提供了一種可能的新型生物墨水[1,5]。

本文主要總結了SF材料的基本特性，探討了其作為生物墨水材料的要求和可加工性，綜述了近年來SF水凝膠墨水材料在生物3D打印領域中的研究進展，并對其所面臨的挑戰以及未來的發展前景進行了討論。

1 SF在生物3D打印領域的發展

生物3D打印技術自誕生以來就備受關注，該技術以活細胞、細胞因子和生物材料為原料打印活體組織，在再生醫學研究領域表現出巨大的應用前景[6]。1988年，KLEBE[7]最早提出采用噴墨打印機將細胞精確定位，以構建二維和三維結構體，這項工作為生物3D打印技術奠定了初步基礎。隨后生物3D打印技術蓬勃發展，2005年，YAN等[8]開發了擠出式生物3D打印技術以構建細胞生物材料復合三維結構體。之后，隨著第1臺商業用生物3D打印機的上市，該技術逐漸成熟，開始了選擇合適生物墨水材料進行3D打印的探究。

采用生物3D打印制造，打印方法和生物墨水材料是2個基本的關鍵要素,對打印結構體的強度、形狀和打印分辨率等因素的控制，主要取決于3D打印制造方法。打印所用的生物墨水作為生物3D打印的核心之一，是生物3D打印產品成功的關鍵。打印所用的生物墨水可以分成含細胞和不含細胞2種；生物打印也相應的有2種策略：一種是先打印出支架再接種種子細胞的間接打印;另外一種是支架材料和種子細胞一起打印的直接打印。在生物墨水的選擇上，具有高含水量和形狀可塑性的水凝膠由于具有與天然組織相類似的微環境，適合包裹細胞進行生物3D打印，被廣泛應用于生物墨水材料。SF作為一種已被廣泛認可的生物材料，因其所具備的天然成凝膠特性成為了具有吸引力的生物墨水候選者。2015年，研究者成功制備了SF基生物墨水，隨后進行了墨水的層級打印、軟組織重建等嘗試[9-12]。最近塔夫茨大學研究團隊通過生物3D打印技術打印了一種兼具促血管和神經支配的SF/羥基磷灰石支架[13]。前期研究表明,基于SF的生物墨水在生物3D打印技術中展現出巨大的研究和應用價值;然而加載活細胞、生長因子和生物功能性物質的生物墨水仍處于生物3D打印研究的早期階段,因此，迫切需要進一步探索基于SF作為打印墨水的要求和可打印性。

2 SF的結構與重要特性

家蠶是SF材料的主要來源，家蠶吐出的桑蠶絲中主要包括SF和絲膠蛋白，此外還有少量的蠟質、色素和無機物等雜質[14]。SF是一種具有半結晶結構的纖維蛋白，這種結構為其提供了一定的剛度和強度。絲膠是一種膠狀的水溶性的蛋白質，作為膠黏劑保持纖維的結構完整性，通過堿性脫膠法可去除[15]。SF占蠶絲總質量的70%～75%，目前一致認為它是由分子質量約為26 ku的輕鏈和分子質量約為390 ku的重鏈通過二硫鍵結合，并以非共價鍵方式與糖蛋白P25連接在一起[16]。重鏈、輕鏈和P25的分子比例為6∶6∶1。SF結晶區和非晶區中的二級結構主要為無規卷曲、α-螺旋、β-轉角和β-折疊，它們的形成與SF的一級氨基酸序列直接相關。家蠶SF包含45.9%的甘氨酸(Gly)、30.3%的丙氨酸(Ala)、12.1%的絲氨酸(Ser)、5.3%的絡氨酸(Tyr)等多種氨基酸[17]。SF重鏈的疏水區域包含一個高度重復的六肽氨基酸序列(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser)，構成了反平行的β-折疊結構并形成大部分結晶區域。重復性較低的六肽氨基酸序列(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Tyr)構成β-轉角并形成半結晶區域。蠶絲的結構如圖1[18-20]所示，絲膠包裹在2束平行的SF纖維表面，將它們綁定在一起。各種研究表明，反平行的β-折疊納米晶體通過提供剛性有序的交聯域來顯著提高蠶絲的力學強度，而由β-轉角、α-螺旋和無規卷曲結構組成的半無定形基質在結晶域之間提供彈性和物理聯系。輕鏈上的氨基酸序列是不重復的，所以輕鏈更加親水并且相對有彈性[1,18]。

圖1 桑蠶絲的多層次結構Fig.1 Multi-level structure of mulberry silk. (a)Schematic diagram of multi-level structure of single mulberry silk; (b)Scanning electron microscope images of natural mulberry silk; (c)Schematic diagram of amino acid sequence in SF crystal region

由于SF特定的化學組成和結構，使其展示出良好的生物相容性，為SF材料應用于生物3D打印提供了可能。1995年，MINOURA等[21]首次評估了SF的生物相容性，發現其對細胞的粘附和生長作用同膠原蛋白一樣。更多的研究表明脫膠的SF纖維沒有明顯的巨噬細胞活化行為，證明了其較低的潛在炎癥和免疫原性，SF材料可適用于進行體內移植和細胞培養[22-23]。迄今為止，SF生物材料因其較好的生物相容性、低免疫原性和較好的力學強度等特點使其在生物醫學領域中發揮著重要的作用[24]。

根據常規的溴化鋰溶解方案，天然桑蠶絲通過脫膠、溶解、透析和純化后可獲得再生SF溶液。通常，再生SF溶液是以一種亞穩定狀態形式存在，即在無任何外界處理的情況下，SF溶液也會隨著時間的推移向SF凝膠轉變，但是自然凝膠過程相對比較緩慢，所需時間可長達數月[25]。由于SF的肽鏈中含有豐富的極性氨基酸，而這些極性氨基酸的側基又含有活性較強的基團，因此，很容易通過化學或物理交聯方法促使SF的β-折疊聚集體的形成或纖維蛋白分子的交聯形成水凝膠，包括機械攪拌、超聲波處理、溫度調控、離子交聯或生物酶交聯、pH值調節和有機溶劑調節等(見圖2[26])。SF水凝膠優異的生物特性使其適合包裹細胞進行生物3D打印，并可應用于軟骨、皮膚、血管和骨組織修復等生物醫學領域。此外，SF來源豐富、易于制造或加工，且所形成的水凝膠具有可調節的生物降解性，同時還具有無免疫原性，即材料在植入后不會引發先天或適應性免疫反應[27]。這些特點使得SF凝膠成為了生物3D打印理想的生物墨水材料來源。然而，由于較低的濃度和黏度，未經加工的SF水凝膠無法直接應用于生物3D打印制造，需要改善其可打印性和生物功能。

圖2 SF水凝膠的交聯方式及其3D打印結構體在組織工程領域的應用Fig. 2 Crosslinking of SF hydrogels and application of 3D-printed structures in tissue engineering

3 生物3D打印對生物墨水的要求

在生物3D打印過程中，對生物墨水最基本的要求是具有良好的可打印性，而且還必須具備合適的交聯機制來完成所需結構體成形(形狀保真度)，并且需要能夠保護細胞在打印過程中免受壓力作用，保持較高的細胞活性，如圖3[28]所示。決定水凝膠生物墨水可打印性的主要物理化學參數是其流變特性和交聯機制。同時特定的打印參數，如噴嘴規格會決定嵌入細胞所承受的剪切應力，打印時間也會影響嵌入細胞的活力。最后，一旦水凝膠前體被打印出來并且細胞存活下來，打印的構建體必須擁有或可被賦予形狀保真度和足夠的機械穩定性。此外，在使用具有不同溶脹行為的生物墨水時，還必須考慮水凝膠的膨脹或收縮特性。面對生物3D打印中對生物墨水的苛刻要求，開發用于生物制造的水凝膠系統，即適用于3D打印和細胞培養的水凝膠生物墨水仍然是一個挑戰。

圖3 水凝膠生物墨水在生物3D打印中至關重要的影響因素及其相互關系示意圖Fig.3 Schematic diagram of the critical influencing factors and their relationship of hydrogel bio-ink in biological 3D printing

這些對生物墨水的要求和不同的生物3D打印技術是相互關聯的，并且是十分重要的。面對不同的生物打印技術，包括擠出式生物3D打印技術、光固化生物3D打印技術和噴墨生物3D打印技術，每種打印技術都基于不同的物理過程，這些過程定義了合適的生物墨水的標準[29]。

3.1 擠出式生物3D打印技術

擠出式生物3D打印技術具有靈活性好、打印速度快、易于操作等優點，是目前3D打印SF基水凝膠中最常用的一種技術[26]。該技術可以通過氣動、活塞或者螺旋結構來分散生物墨水，這種技術的優點是能夠輸送的細胞和材料選擇性廣泛，并且能夠分散具有高細胞密度的高黏性生物墨水[29]。此外，該技術打印的細胞具有較高的細胞活力，通常高于90%。但該技術的打印分辨率較低，其打印精度和可行性主要取決于水凝膠的流變性能和固化成形性能。對于擠出式生物3D打印而言，水凝膠墨水流變性能的研究和優化是極為重要的。由于單純SF水凝膠較低的濃度和黏度，需要通過各種物理化學手段改善和優化其流變性能。在對墨水材料流變性能的研究中，通常可采用旋轉流變儀來進行測試，常使用3種典型流動幾何形狀[30]，測試內容一般包括流動測試和振蕩測試。其中流動掃描一般采用步階速率，目的是獲取流體的穩態流動曲線。水凝膠具有剪切變稀的特性是其可打印的關鍵，因為剪切變稀特性一方面可以保證水凝膠能夠順利被擠出，避免過多的流體剪切應力和高黏度堵塞的可能性；另一方面可以保證擠出的長絲保持其形狀，提高打印穩定性并確保打印結構的精度。振蕩測試一般包括振幅掃描和頻率掃描等，振幅掃描的目的是確定水凝膠的線性黏彈區，頻率掃描是檢測水凝膠對頻率的響應能力以及探測凝膠的結構信息。GHOSH等[31]于2008年使用濃縮的質量分數為28%～30%的絲素溶液作為墨水，并通過噴嘴處的甲醇溶液觸發SF結構的轉變，成功實現了SF基生物墨水的擠出式3D打印。

3.2 光固化生物3D打印技術

光固化生物3D打印是一種通過光激發、分層固化的3D打印技術，具有高分辨率、可實現復雜結構精細打印的特點[32]。該技術是基于紫外光光敏材料聚合物的原理，選擇性地進行逐層固化液態光敏聚合物。這就要求水凝膠需同時具備2種特性：生物相容性和光敏特性。因為單純的SF不能發生光聚合反應，所以一般會選擇加入光引發劑，這樣在打印過程中，可通過調控光強和曝光時間等打印參數來調節固化動力學。KIM等[32]首次合成了甲基丙烯酸縮水甘油酯改性SF，使SF通過曝光聚合，成功突破了SF與光固化生物3D打印技術不兼容的難題。

3.3 噴墨生物3D打印技術

噴墨3D打印也是生物3D打印中最常用的方法之一，因其特殊的工作過程，微滴化、高通量、非接觸式和按需滴落是該技術的基本特征。它的原理就是在噴嘴處安裝壓電陶瓷或者微型的加熱器，利用熱量產生氣泡將生物墨水從噴嘴噴出，從而形成液滴。液滴的大小可以通過改變打印條件來控制，如溫度、黏度等[33]。應用于噴墨打印的墨水材料要求低黏度以避免堵塞噴頭。此外，對于給定的噴嘴，墨水的表面張力也需要考慮，因為噴嘴的浸潤性可能導致形成的是噴霧而不是形成墨滴的噴射，所以除了黏度之外，墨水的密度和表面張力可能會影響墨水的流動和液滴形成，也需要進行考慮。噴墨打印技術可以精確地將SF基水凝膠打印出多種多樣的構造，具有產生圖案化結構的能力。當然，在打印過程中也還存在液滴方向性不能精確控制，噴嘴易堵塞，打印出的幾何形狀不規則等問題[33]。2006年，LIMEM等[34]將水溶性絲素溶液打印到乙烯基塑料基片上，形成一系列具有梯度分離距離的平行線，將噴墨3D打印技術應用在打印SF結構體上。

4 SF基墨水的生物3D打印研究

SF具備良好的生物相容性、低免疫原性、可調的力學性能和充足的來源等特性，顯示出其作為生物3D打印墨水的優勢[35];但是由于再生SF溶液的低濃度和低黏度阻礙了其在生物3D打印的廣泛應用[36],因此，研究者基于再生SF水溶液的物理化學特性，優化水凝膠的可打印性、力學性能和形狀保真度等基本參數，從而使SF顯示出強大的生物3D打印生命力[37]。目前通常通過采用加熱和聚乙二醇溶液濃縮的手段來提高SF水溶液的濃度，或通過添加有機溶劑來滿足生物墨水的流變性能要求。然而，在加熱和濃縮過程會改變SF溶液的二級結構，有機溶劑的殘留物也會對細胞活力產生不利影響。目前許多研究者采用通過摻混其他高黏度生物材料來獲取良好流變性能的SF基生物墨水。這一方法大大改善了SF材料在生物3D打印中的應用。多組分生物墨水不僅可以保存單個組分的優點，且可以通過原料的篩選和配方的優化調控生物墨水一系列的物理、化學和生物學特征，從而改善其可打印性和生物功能性[38]。

4.1 復合人工合成聚合物的SF基生物墨水

合成聚合物種類豐富，雖然生物相容性較差，但其結構與性能可控，重復性較好。將SF與合成聚合物復合，合成聚合物中的大分子基團會影響SF的結構構象，致使通過一定物理或化學交聯形成的復合水凝膠兼具天然SF優良的生物相容性與合成聚合物高彈性形變和強度等力學性能的優勢[39]。

EGAWA等[40]將不同含量的SF與光固化樹脂聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)混合制備形成復合生物墨水，通過光固化3D打印技術打印形成SF/PEGDMA復合水凝膠支架。研究結果表明,復合墨水中SF的含量可有效調控最終打印結構體的微孔結構、壓縮強度和壓縮模量。打印的水凝膠的彈性壓縮模量具有廣泛的可調范圍，表明可通過控制SF的含量構建適用于不同組織特性的支架。KIM等[32]通過甲基丙烯酸酯取代SF的伯胺構建了一種SF基生物墨水(Sil-MA)，用于光固化生物3D打印技術。研究結果表明，Sil-MA水凝膠墨水具有出色的機械和流變特性，可構建高度復雜的器官結構，包括心臟、血管、大腦、氣管和耳朵，具有優異的結構穩定性和可靠的生物相容性。LI等[41]開發了一種由聚己內酯(PCL)和SF組成的生物墨水，并通過擠出式3D打印技術構建了仿生復合組織工程半月板支架。實驗結果表明，結合SF和PCL這2種組分的復合支架顯示出優越的生物力學、結構和功能，能有效促使滑膜間充質干細胞(SMSC)增殖、分化和細胞外基質的產生，并能顯著地增強半月板再生以及對軟骨組織起到明顯的保護作用。

4.2 復合天然聚合物的SF基生物墨水

天然聚合物材料具有優良的生物相容性、生物降解性和可吸收性等，將天然聚合物材料與SF復合，在一定程度上能夠提高SF的力學性能和可打印性，同時能夠更好地保留SF優良的生物特性。常見的與SF復合的天然聚合物主要有明膠、海藻酸鹽、纖維蛋白、膠原、透明質酸鈉、殼聚糖和脫細胞外基質等[39]。

LI等[42]將SF與膠原蛋白材料復合作為生物墨水，基于擠出式生物3D打印技術設計并成功構筑了模擬皮層脊髓束結構的膠原蛋白/絲素蛋白支架(3D-C/SF)。研究結果表明，與正常冷凍干燥技術形成的C/SF支架相比，通過3D打印技術可精確定義支架的微觀和宏觀結構并顯著改善支架的功能特性，基于仿生結構設計的3D-C/SF植入物有助于脊髓帶的重新定位并促進軸向連接，并且在適當時間內可達到良好的修復效果，有助于神經再生和運動功能的穩定恢復。KIM等[43]利用離子交聯技術制備出海藻酸鹽復合SF(Alg/SF)生物墨水，通過光固化3D打印技術制備三維結構。研究結果表明，與傳統的Alg水凝膠相比，3D打印的Alg/SF支架表現出良好的細胞親和力和尺寸穩定性。LEE等[44]以核黃素為光引發劑，通過在SF中加入明膠(gelatin)獲得結構穩定的水凝膠墨水，SF/gelatin復合墨水良好的可打印性使其可通過光固化3D打印技術實現復合墨水的3D打印。

4.3 復合無機功能材料的SF基生物墨水

近年來，為了進一步提升SF基生物墨水的可打印性和功能性，研究者嘗試將多種聚合物與SF復合，或者是加入功能性的無機材料，賦予SF基墨水更佳的打印分辨率、形狀保真度和足夠的力學穩定性，并且兼具多功能性，從而增加SF材料的應用前景。

SANGKERT等[45]通過海藻酸鹽(Alg)、聚乙烯醇(PVA)結合SF開發仿生水凝膠墨水，利用3D打印技術打印形成支架。Alg可使3D打印支架具有良好的穩定性，PVA具有獨特的粘附功能，SF中則含有一些能誘導新骨形成的氨基酸。將支架與成骨細胞一起培養，研究結果表明，SF的存在使打印的復合支架具有較低的溶脹性和較高的降解性，并且顯示出良好的細胞粘附、活力和增殖以及良好的堿性磷酸酶活性、蛋白質合成和鈣沉積，該SF基3D打印支架在頜面部手術中具有良好的應用前景。KADUMUDI等[46]利用單寧酸作為酚醛膠分子與SF、石墨烯和氯化鈣共混，以制造無機-有機混合多組分水凝膠(CareGum)。借助熱輔助擠出3D打印技術，CareGum可打印成各種復雜多層結構，包括螺旋、正方形、立方體、金字塔和圓柱體等。3D打印的CareGum支架結構堅固并具有彈性，足以支撐自身的質量，并且CareGum所具有的自愈性有助于非常快速地穩定打印層間結構，以形成最終的三維結構體。此外，CareGum多組分的巧妙搭配促使CareGum展現出多功能性，如高機械韌性、約25 000%的伸長能力、對任意和復雜表面的優異順應性、在各種材料表面良好的粘附性和優異的導電性。CareGum作為一種具有前景的新型先進材料可廣泛應用于3D打印、機器人、人機交互界面和柔性生物電子器件等領域。

5 結束語

SF水凝膠良好的生物相容性、可調的力學強度和降解性，近年來成為了生物墨水絕佳的候選材料，在生物3D打印中得到了高度的關注。盡管已經報道了許多可適用于不同3D打印技術的基于SF研發的生物墨水，但將這項技術真正應用于臨床仍然需要在許多方面繼續努力。

SF水凝膠的結構穩定性差、含水量和黏彈性高，這些缺點對精確打印高分辨率的仿生結構構成了重大挑戰。在SF基生物墨水的設計和加工中，需要考慮一系列的物理、化學和生物學特征，特別是在其黏度、流變性、獨立和適用的力學性能、生物降解性、生物相容性以及生理條件下的細胞裝載和封裝能力等方面。目前已報道的方法主要是通過調控SF的濃度或摻入其他材料，但是大多數方法為了獲得高分辨率的打印結構體而加入一系列的化學試劑，一定程度上會破壞SF材料的綠色天然屬性和生物相容性特征。這需要對這種生物墨水材料基本特性有更深入的理解，系統地理解特定流變特性對可打印性和形狀保真度的作用，在SF基生物墨水3D打印的要求方面需建立系統的知識儲備，為基于SF的生物墨水設計提供參考，以加速研發新型的生物墨水。

此外，不只是專注于優化SF基生物墨水設計，還可考慮修改打印環境以允許SF基水凝膠和細胞懸浮液的高形狀保真度打印，如通過懸浮浴打印。同時，多種生物3D打印技術的聯合使用，或者是新型打印技術的開發都會為SF 基生物墨水的3D打印制造提出新的技術解決方案。相信在未來，隨著生物技術的發展，通過生物3D打印形成的SF基水凝膠構建體在生物醫學領域會有更廣闊的應用前景。

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