實驗室培養(yǎng)人類胚胎的下一步是什么？

編譯 米斛

在阿里·布里瓦盧（Ali Brivanlou）的實驗室中正在進行胚胎第13天的實驗。他們現(xiàn)在即將面臨一項煩人的實驗。這個團隊的研究方向是發(fā)育生物學，他們在此之前解凍了十幾個人類胚胎并將它們分別放置在培養(yǎng)皿中，從而觀察這些胚胎在發(fā)育最早期的成長過程。全世界的研究者只有少部分人見過這個過程。但阿里知道，這一系列實驗即將結(jié)束。

隨著胚胎的生長，它即將超過“14天規(guī)則”的限制。14天規(guī)則是一項國際共識，該規(guī)則要求實驗室培養(yǎng)的胚胎只能成長到受精后的第14天。第14天大致是原條出現(xiàn)的時間，而原條的出現(xiàn)標志著胚胎軀體中軸的建立，并開始區(qū)分頭尾和左右。

回憶起2015年他在紐約洛克菲勒大學實驗室的實驗，布里瓦盧說：“現(xiàn)在是時候結(jié)束這項實驗了。這是我一生中做過的最艱難的決定之一。”在胚胎生長的第13天，團隊人員將胚胎從培養(yǎng)皿的底部剝離并冰凍以防止其進一步發(fā)育。“我們不知道在第14天后會發(fā)生什么。”布里瓦盧說。

現(xiàn)在，布里瓦盧和其他的發(fā)育生物學家有機會一探究竟。

這張圖展示的是實驗室培養(yǎng)了12天的人類胚胎。紫色的細胞就是組成人類胚胎的細胞

國際干細胞研究協(xié)會（ISSCR）在2021年5月發(fā)表的新指南中放寬了14天規(guī)則，移除了規(guī)則中的硬性規(guī)定。盡管全世界只有幾個實驗室能夠充分滿足培養(yǎng)人類胚胎14天所需的條件，但科學的進步是很快的。在一些國家中法律允許將胚胎培養(yǎng)至14天之后，而14天規(guī)則的松動則讓這些國家的研究團隊能夠向監(jiān)管者申請將胚胎培養(yǎng)至14天之后。在母體中，胚胎一般在受精一周后著床。而這些研究能夠向我們展現(xiàn)著床之后人類胚胎的發(fā)育。在著床之后，也就是胚胎受精后大約14～22天，胚胎開始形成原腸。在這一發(fā)育階段中胚胎大致長出了身體的形狀，也為器官形成打下了基礎(chǔ)。

有1/3的流產(chǎn)和眾多先天畸形發(fā)生在懷孕初期。通過觀察14天之后的胚胎發(fā)育，科學家能夠更好地理解這些流產(chǎn)和先天畸形的發(fā)生機制。此外，這些階段中隱藏著細胞分化成組織和器官的線索，而這些線索能夠推動再生醫(yī)學的發(fā)展。

大多數(shù)研究者期望布里瓦盧的團隊和其他這一領(lǐng)域的團隊能夠迅速推動人類胚胎培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，從而延長胚胎培養(yǎng)的時間。能夠做到這一點的團隊之間已經(jīng)開始了激烈的競爭。在其他國家，這樣的研究則被法律所限制。來自昆明理工大學的胚胎學家李天晴表示，一些中國的研究者正在討論是否修改依據(jù)14天規(guī)則制定的政策。

所以目前研究人員還不認為會有大量新的關(guān)于14天后胚胎的研究，且也不是所有研究者都認可這樣的實驗。一位來自倫敦弗朗西斯·克里克研究所的發(fā)育生物學家內(nèi)奧米·莫里斯（Naomi Moris）說：“我很擔心如果把人類胚胎用作科學研究，它們自身的權(quán)利能否得到保障。”

為了繞開對胚胎培養(yǎng)的限制，研究者在過去5年間制作了一系列人類胚胎模型，而其中大多數(shù)則是由干細胞混合而成。這些模型粗略模仿了許多早期胚胎發(fā)育的階段，并且不使用稀少且會觸及倫理學問題的人類胚胎（這些胚胎是接受試管嬰兒輔助生殖的人們捐贈的）。截至目前，14天規(guī)則并不適用于這些胚胎模型。但當這些由干細胞組成的胚胎模型變得越來越復雜，甚至有發(fā)育出可辨識的結(jié)構(gòu)甚至器官的可能時，這些模型就進入了自身所屬倫理學范疇的灰色地帶。

不論是使用模型或是真正的人類胚胎，科學家知道他們還有很多未知需要探索。來自維也納奧地利科學院分子生物研究所的干細胞生物學家和胚胎學家尼古拉斯·利伏龍（Nicolas Rivron）說：“胚胎都是偉大的大師，它們告訴我們成型和衰老的全部。”

突破極限

在1979年，伴隨著試管嬰兒技術(shù)的出現(xiàn)，人類胚胎首次在體外出現(xiàn)，14天規(guī)則隨之被首次提出——即使在當時的條件下這些胚胎僅能存活幾天。在國際干細胞研究協(xié)會于2006年簽署的第一份人類胚胎干細胞研究指南中，14天規(guī)則正式在學術(shù)界被確立。

這份指南在世界范圍內(nèi)被研究者廣泛采納。在包括德國和奧地利在內(nèi)的幾個國家中，利用人類胚胎進行實驗是非法的。而像英國、中國、日本、澳大利亞和加拿大這些國家則將14天規(guī)則寫入了法律。盡管在諸如美國和以色列等國家只有指南沒有法律禁止或限制，但這樣的研究不能獲得美國聯(lián)邦政府資助。

國際干細胞研究協(xié)會上一次更新發(fā)布指南是在2016年，隨即就有兩個研究組發(fā)布了他們突破性的研究成果。

瑪格達萊娜·澤爾妮卡-戈茨（Magdalena Zernicka-Goetz）的實驗室位于英國劍橋大學。他們在2013年就開始探索將人類胚胎培養(yǎng)超過7天。這個研究組希望了解囊胚形成之后的發(fā)育過程。她的研究團隊精確地調(diào)整了激素和生長因子的配方，并在2016年報道了他們已經(jīng)能夠?qū)⑷祟惻咛ヅ囵B(yǎng)至第12～13天，同時布里瓦盧的團隊也報道了相似的成果。

澤爾妮卡-戈茨說：“我們的發(fā)現(xiàn)，例如頭部發(fā)育的過程，是十分重要的。”澤爾妮卡-戈茨現(xiàn)在同時就職于她在英國和美國加州理工學院的實驗室。她補充道：“我被第二、第三、第四周的胚胎發(fā)育過程深深吸引著，這段時期的胚胎發(fā)育過程無法通過超聲了解，但身體主要器官的前體在這段時間開始形成。”

在胚胎生長時，基因在胚胎細胞中如何表達一直困擾著科學家。在迄今規(guī)模最大的人類胚胎研究中，澤爾妮卡-戈茨的團隊分析了4 820個單細胞。這些細胞來自實驗室培養(yǎng)的16個胚胎，包括了從正常著床的第5天到原腸開始形成的第11天的各個階段。單細胞RNA測序能夠反映出哪些基因不再表達，而哪些基因在全能干細胞分化為多能干細胞時表達。

盡管我們已經(jīng)了解小鼠體內(nèi)的發(fā)育信號，這項研究第一次揭露了參與人類胚胎發(fā)育過程的分子。

有些實驗只能在實驗室培養(yǎng)的人類胚胎上進行。在這些實驗中，澤爾妮卡-戈茨和布里瓦盧以及他們的團隊都關(guān)注到了非整倍體細胞。這些細胞的染色體數(shù)目不同于正常細胞，而染色體數(shù)目異常則會導致超過一半的早期流產(chǎn)。

試管嬰兒技術(shù)在臨床上一般只會分析幾個胚胎細胞的基因情況。但通過實驗，我們發(fā)現(xiàn)這種分析方法產(chǎn)出的結(jié)果可能具有誤導性。澤爾妮卡-戈茨的團隊發(fā)現(xiàn)部分帶有非整倍體細胞的胚胎仍能在實驗室環(huán)境下正常發(fā)育。布里盧瓦的團隊則分析了人類胚胎從第3天到第14天的基因表達，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目異常的細胞在發(fā)育的過程中消失了——也可能是發(fā)育成了支持組織或細胞因死亡而被清除。兩個實驗都提示，臨床上檢測體外受精人類胚胎的非整倍體細胞可能錯誤地將一些胚胎判定為“不健康”。

布里瓦盧表示，使用人類胚胎對于這些發(fā)現(xiàn)是至關(guān)重要的。他說“除了通過觀察胚胎發(fā)育，我們沒有別的方法做出這些發(fā)現(xiàn)”。他正在設計其他實驗——一些可能會將培養(yǎng)期限延長至14天之后——試圖發(fā)現(xiàn)胚胎是如何清除這些非整倍體細胞的。

兩周之后

那些使用動物胚胎進行實驗的研究者已經(jīng)將動物胚胎培養(yǎng)至相當于人類胚胎的14天之后。這些動物胚胎的培養(yǎng)技術(shù)能夠為延長人類胚胎培養(yǎng)時間鋪平道路。2021年3月，在以色列雷霍沃特的魏茨曼科學研究所中，雅各布·漢娜（Jacob Hanna）的團隊將小鼠胚胎的培養(yǎng)時間從5.5天延長至11天（大致相當于將人類胚胎培養(yǎng)時間從13天延長至30天）。盡管其他研究者認為這一過程是極為困難的，但這些小鼠胚胎都正常地開始了器官發(fā)育。

布里瓦盧和澤爾妮卡-戈茨都計劃進一步推動人類胚胎培養(yǎng)的極限，就像漢娜的團隊在小鼠胚胎上實現(xiàn)了從5.5天至11天的培養(yǎng)時間那樣。布里瓦盧希望搞清干細胞內(nèi)部的基因是如何促使其分化為大腦細胞的，也想了解四腔心是如何在分子的引導下形成的。這兩個事件都發(fā)生在人類胚胎受精的14天之后，解開這些謎題能夠為了解神經(jīng)發(fā)育異常和常見的先天性心臟病的發(fā)生機制提供思路。

布里瓦盧和其他的發(fā)育生物學家表示，未來，研究者技術(shù)上將能夠?qū)崿F(xiàn)在實驗室中觀察人類胚胎著床的過程。他的團隊正在向其所屬大學的管理委員會申請將胚胎培養(yǎng)的時限延長至第21天。在這一周中，胚胎會確定哪些結(jié)構(gòu)會發(fā)育成大腦、脊髓、骨骼、心臟、血液、肌肉和面部，確定整個身體的發(fā)育計劃。布里瓦盧說：“我不知道我們能否將胚胎培養(yǎng)延長至14天，但一旦我們成功了，我們需要更加謹慎地進行下一步的實驗。”

胚胎模型

研究者已經(jīng)有一些觀察哺乳動物原腸形成過程的方法了。比如，研究者通過觀察混合后的干細胞建立胚胎的三維模型，而非使用真的人類胚胎。在過去的五年間，研究者建立了各種各樣的胚胎模型來探索14天后的胚胎發(fā)育。在大多數(shù)情況下，這些胚胎模型不受14天規(guī)則或任何特別審查的限制。

這些用于模擬囊胚階段的胚胎模型是將皮膚細胞重新編程后得到的

密歇根大學位于美國安娜堡。在2017年，該校的一位生物醫(yī)學工程師傅建平和他的團隊完成了第一個通過三維培養(yǎng)人類胚胎干細胞制作的人類胚胎模型。該模型中，這些細胞自發(fā)形成了羊膜囊和代表原條形成的第一個標志。這一發(fā)現(xiàn)讓該領(lǐng)域的科學家大為興奮。傅建平說：“存在于胚胎干細胞中的這種可能性讓人著迷。”

與傅建平制作的模型類似，許多模型現(xiàn)在能夠模擬小鼠和人胚胎的最早期階段，例如：著床，原腸形成以及大腦、脊髓和心臟最初階段的發(fā)育。舉例來說，傅建平和其他人構(gòu)建的類神經(jīng)模型能夠模擬大腦和脊髓的前體的形成過程。傅建平認為這個模型能夠幫助研究者培養(yǎng)有正常功能的神經(jīng)元，而這樣的細胞在未來能夠移植到患者體內(nèi)。通過混合干細胞制作的模型經(jīng)常在外觀與行為上類似于真正的胚胎，但我們并不清楚在這些模型內(nèi)部——分子和細胞的行為是否與正常發(fā)育的胚胎一致。

隨著人類胚胎模型越發(fā)復雜，生長時間越來越長，新的倫理學問題也隨之出現(xiàn)。這是傅建平和其他研究者都認同的。比方說模型中的神經(jīng)元能夠發(fā)出電信號，或者模型中的心臟能夠跳動，甚至有些模型能獲得進一步發(fā)育的潛能并突破當前所允許的極限。大多數(shù)模型缺乏完整胚胎形成所需的充分的生命支持組織。但在過去幾年間，許多實驗室已經(jīng)建立了小鼠和人的囊胚期胚胎模型，這些模型被稱為“類囊胚模型”。

國際干細胞研究協(xié)會已經(jīng)注意到了這一類型研究。在其發(fā)布的指南中，含有這些支持組織的模型必須接受特殊的監(jiān)管，并且其生長時間應等同于滿足科學研究所需的最短時間。當支持組織出現(xiàn)時，這些模型就需要重新進行倫理考量。國際干細胞研究協(xié)會委員弗朗西斯·克里克研究所的干細胞生物學家羅賓·貝吉（Robin Lovell Badge）說：“顯然，我們需要監(jiān)督這些領(lǐng)域的研究。”

當胚胎和胚胎模型的研究逐漸深入，科學家開始思考這兩者的相似程度，研究者希望了解在模型與真正的胚胎中分子與細胞的行為有多大的差異，而這也是研究者希望將胚胎培養(yǎng)時間延長至14天之后的主要原因。德國馬克斯·普朗克分子細胞生物學和遺傳學研究所的發(fā)育生物學家杰西·范利特（Jesse Veenvliet）說：“我們能從模型中了解很多，但了解模型中哪里出了問題也同樣重要。”

在2020年，莫里斯和同事比較了小鼠胚胎和小鼠原腸模型的基因表達。他們發(fā)現(xiàn)在發(fā)育的關(guān)鍵節(jié)點上，兩者的基因表達有著驚人的相似。她說：“對于人類胚胎和人類原腸模型也應進行這樣的基準化分析法，而這需要將人類胚胎培養(yǎng)到第21天。”利伏龍則推測了人類發(fā)育各個階段的分子圖譜。

一旦完成充分的基準化分析法，人類胚胎的使用數(shù)量將減少。研究者能夠使用模型替代真正的胚胎。在那時，除非有足夠充分的理由，研究者不會使用人類胚胎進行實驗。

設定時限

但研究者如果要觀察人類胚胎的發(fā)育，他們到底能將人類胚胎培養(yǎng)多久呢？批評者認為國際干細胞研究協(xié)會放寬14天規(guī)則后沒有為研究者提供一個準確的時間限制是一種不負責任的行為。

傅建平是國際干細胞研究協(xié)會的成員，他參與了這份新指南的制作，其間參與了100多個線上會議。他說：“現(xiàn)在科學發(fā)展如此之快，重新制定一個時間限制是十分困難的。”事實上，這份指南允許相關(guān)研究在合理的監(jiān)管下進行。

而布里瓦盧贊同這一決定，他說：“說實話，突破14天規(guī)則有很多好處，甚至能在未來拯救人的生命。”他和貝吉都認為有些突破14天規(guī)則的研究不被允許反而是不符合倫理的。這些研究能夠解鎖器官中不同細胞是如何出現(xiàn)的，也能展示流產(chǎn)和先天畸形是如何發(fā)生的。

那么哪些實驗和胚胎模型與培養(yǎng)超過14天的胚胎研究采用相同的監(jiān)管措施呢？此前這一問題并沒有明確的結(jié)論，而現(xiàn)在國際干細胞研究協(xié)會的指南中給出了一個清晰的界限，即只有包含支持組織的模型和理論上存在完全發(fā)育可能性的模型需要與培養(yǎng)超過14天的胚胎研究采用相同的監(jiān)管措施。（這一指南也禁止將實驗室中的人類胚胎，人與動物的嵌合體胚胎，以及人類胚胎模型移植到人或動物的子宮內(nèi)。）

一些研究者對于放寬14天規(guī)則持保守態(tài)度。莫里斯就是其中一位，他不認為公眾真的有機會來衡量14天后胚胎實驗的后果。

紐約加里森黑斯廷斯中心的生物倫理學家約瑟芬·約翰斯頓（Josephine Johnston）進一步說：“我認為放棄14天規(guī)則的同時沒有為胚胎實驗設置一個新的時間限制是一個錯誤。設置時間限制代表著科學界理解并尊重人類胚胎的社會意義。放棄針對胚胎培養(yǎng)的時間限制可能徹底動搖公眾對科學界的信任。此外，研究者最好能夠解釋清楚如何研究培養(yǎng)超過14天的胚胎才能真正幫助人類。他們需要直截了當?shù)亟忉屌咛パ芯康募毠?jié)。盡管這一領(lǐng)域的許多研究看似遙不可及，但缺乏時間限制還是過于大意了。”

資料來源 Nature