軍團菌耐藥現狀及耐藥機制研究進展

趙子睿 張怡 李萍 陳愉

中國醫科大學附屬盛京醫院呼吸與危重癥醫學科,沈陽 110004

軍團菌是一種革蘭陰性桿菌,因在1976年的一次美國退伍軍人會議上首次暴發并被分離鑒定而得名。該菌廣泛分布于自然界的水和土壤環境中,也存在于公共供水系統如自來水管道、空調冷卻塔水及浴室溫泉等環境中[1],患者吸入含有軍團菌的氣溶膠后細菌進入肺泡巨噬細胞內,在其特有的四型分泌系統作用下,軍團菌能夠成功地躲避溶酶體酶的殺菌作用,并在巨噬細胞中生存繁殖,從而導致軍團病的發生[1-2]。軍團病,表現為軍團菌感染的肺炎型和非肺炎型兩種,非肺炎型又稱龐蒂亞克熱,癥狀表現類似流感,以發熱為主要表現,為自限性疾病；肺炎型軍團病常表現為重癥社區獲得性肺炎。我國于1982年在南京發現國內首個病例,隨后國內相繼出現多起軍團病的暴發與散發病例,但以散發為主[1,3]。目前已知的軍團菌有61種71個血清型,同時還有新的菌種不斷從環境中被發現并分離[4]。在軍團菌中,引起人類軍團病的主要病原是嗜肺軍團菌,其中又以血清型1型嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila1,LP1)為主[5]。自1976年以后,全世界范圍內越來越多的與社區、醫院及旅行相關的軍團病病例及其小規模暴發被報道[6],其嚴重程度從輕度到重度不等,平均病死率為10%,而對于病情危重,未得到及時治療的免疫力低下的患者,其平均病死率達到30%[7]。在臨床上,通常使用大環內酯類和氟喹諾酮類藥物對軍團菌感染進行治療[8],近年來,不斷有研究人員通過在抗菌藥物環境下對軍團菌菌株進行連續傳代培養得到了高度耐藥的軍團菌菌株,證實了軍團菌產生耐藥的可能性[9-11]。同時,國內外均發現環境中分離出的菌株對治療藥物存在耐藥的情況[12-13]。由于軍團菌肺炎在臨床常為重癥,及時有效的治療對預后至關重要,一旦產生耐藥,將危及患者生命。盡管新近應用的替加環素等四環素類抗菌藥物被報道對于治療軍團菌肺炎有較好的治療效果,但未見軍團菌對該類藥物耐藥方面的研究。因此,本文重點針對大環內酯和氟喹諾酮類的耐藥現狀及耐藥機制作一綜述,臨床醫生對該方面的了解將為治療決策的制定及調整提供參考。

一、不同來源的軍團菌耐藥現狀

(一)來自環境的菌株

軍團病主要通過吸入環境中污染軍團菌的氣溶膠發病,因此對環境中軍團菌的耐藥性監測顯得十分重要。國內學者Jia等[14]對收集自2005-2012年的149株嗜肺軍團菌1型菌株進行了藥敏檢測,這些菌株包括來自北京、上海、深圳、無錫、濟南、石家莊等地的臨床軍團病患者的19株臨床菌株和來自醫院、社區等公共場所的冷卻塔水、溫泉水和管道水環境中的130株環境菌株,最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)范圍為0.032～2.0 mg/L,其中25株軍團菌存在對阿奇霉素的耐藥,耐藥率為16.78%(25/149),并且這25株全部是來自環境的菌株,占環境菌株的比率達19.23%,基于測序分型(sequencing based typing,SBT)顯示這25株耐藥菌株包括ST1、ST150、ST144、ST629和ST154,其中ST1型的菌株占到所有耐藥株的84%。在149株軍團菌菌株中沒有發現對左氧氟沙星,環丙沙星及利福平耐藥的菌株。董穎等[15]在進行軍團菌的體外藥物活性研究時也發現10株對阿奇霉素MIC＞1 mg/L的嗜肺軍團菌菌株,其中7株為血清型1型,另外3株為非血清型1型的嗜肺軍團菌菌株,但它們均為環境中分離的菌株,沒有發現對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株。在2017年,波蘭的研究人員在一家療養院的供水系統中分離出了一株對阿奇霉素耐藥的非血清型1型的嗜肺軍團菌,并且該耐阿奇霉素菌株同時表現為對環丙沙星和利福平的敏感性降低[12]。2019年,挪威的研究人員對收集自環境的67株和來自臨床患者的55株軍團菌進行了藥敏檢測,其MIC范圍為0.032～1.0 mg/L,其中17.91%的環境菌株都存在對阿奇霉素敏感性降低,并且所有對阿奇霉素的MIC≥0.5 mg/L的菌株均帶有外排泵基因,同時受試菌株中所有ST1型菌株均存在對阿奇霉素的敏感性降低的現象,沒有發現對環丙沙星和左氧氟沙星等氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株[16]。在對希臘一所醫院進行的供水系統采樣檢測中發現,在所分離的20株嗜肺軍團菌菌株中,有3株對紅霉素有輕微耐藥,其中2株MIC為1 mg/L,另一株為0.75 mg/L,另有2株對環丙沙星存在輕微耐藥,MIC為2 mg/L[17]。此外,印度的醫院供水系統中分離出環丙沙星MIC=2 mg/L的嗜肺軍團菌菌株,但未發現對阿奇霉素存在耐藥的軍團菌菌株[18],意大利一家醫院的供水系統中發現2株阿奇霉素MIC=3 mg/L和MIC=4 mg/L的嗜肺軍團菌菌株,但并未發現對環丙沙星存在耐藥的菌株[19]。這些抗藥性在地理上存在一定差異,可能是由于醫療衛生狀況的實踐,也有可能是由于每個國家的農業、漁業和肉類行業的抗菌藥物使用水平和狀況不同[20],從而導致了軍團菌的耐藥基因在不同地理分布上出現了差異[21]。顯而易見的是,不同區域菌株敏感性的數據對指導當地臨床治療更有實際意義,在臨床用藥過程中應予以考慮和重視。

(二)來自臨床的菌株

在軍團病的治療中,軍團菌耐藥性的檢測對其具有重要意義。通過以往的研究資料來看,在實驗室中,可以很容易通過培養篩選得到具有對大環內酯類藥物或氟喹諾酮類藥物具有耐藥性的嗜肺軍團菌菌株[10-11,22],然而臨床上并沒有出現對大環內酯類藥物具有耐藥的軍團病病例報告,但是存在對阿奇霉素敏感性降低的臨床分離株亞群,利用分子系統發育分析LP1的阿奇霉素MIC和LP1菌株的SBT分型型別關系后,研究人員發現來自臨床的軍團菌菌株對阿奇霉素敏感性降低與lpe AB基因編碼的大環內酯外排泵有關[9]。在Natas等[16]研究收集自2000-2017年的55株臨床菌株中有9株對阿奇霉素敏感性降低,達到16.36%,他們的后續研究也顯示這些對阿奇霉素敏感性降低的菌株均存在lpe AB外排泵的表達。而對氟喹諾酮類藥物具有耐藥的臨床分離的菌株,目前報告較少[23]。2012年,Bruin等[24]研究報道了一株嗜肺軍團菌菌株的臨床分離株,其對阿奇霉素和環丙沙星的耐藥性超出了其野生型范圍,其中環丙沙星MIC為2 mg/L,阿 奇 霉 素MIC為6 mg/L。2014年,Bruin等又從1例環丙沙星治療失敗的軍團病患者身上分離出來對環丙沙星耐藥的軍團菌菌株,其環丙沙星的最低抑菌濃度為2 mg/L,超出其流行病學界值(epidemiological cutoff,ECOFF)1 mg/L,具有潛在耐藥性,在后續對該菌株的基因測序結果中,顯示其耐藥性來自gyr A基因喹諾酮耐藥決定區(quinolone resistance-determining region,QRDR)的點突變[23]。隨后,在一項有82例互不相關的軍團病患者參與的臨床研究中,Shadoud等[25]對來自82例軍團病患者住院和抗菌藥物治療期間的共139份呼吸道標本進行實時PCR檢測,并進行了深度測序檢測了嗜肺軍團菌的抗性突變,通過對患者抗生素治療過程的不同時期呼吸道標本進行實時熒光定量PCR確認和量化標本中QRDR突變區Gyr A基因的變化情況,動態監測了患者體內軍團菌的耐藥基因水平,結果顯示存在QRDR gyr A突變的兩例患者中,第一例患者確診軍團病當天的呼吸道樣本中的軍團菌gyr A83突變基因的頻率為2.9%,而在其接受氟喹諾酮類藥物治療4 d后的樣本中軍團菌gyr A83突變基因的頻率上升為94%；另一例患者在確診軍團病當天的標本中軍團菌的gyr A83突變基因頻率為1.05%,而其氟喹諾酮類藥物治療后的第3天和第5天標本中軍團菌的gyr A83突變基因頻率上升為75%和85%,其研究結果證明了軍團病患者體內嗜肺軍團菌耐藥性選擇的發生與氟喹諾酮類藥物的應用有直接關系,并且其耐藥性選擇發生于氟喹諾酮類藥物治療之后。

二、軍團菌耐藥的機制

(一)軍團菌對大環內酯類藥物的耐藥機制

大環內酯類藥物的主要抗菌機制為透過細胞膜進入軍團菌內與軍團菌70S核糖體的50S亞基結合,結合位點為蛋白質合成過程中必須的肽鏈延長段,與t-RNA結合位點形成競爭效應,抑制軍團菌菌體蛋白的合成,從而達到抑菌的作用[26-27]。細菌對大環內酯類藥物的耐藥性獲得主要通過以下機制:通過甲基化酶修飾核糖體靶標[28],點突變修飾核糖體上大環內酯類藥物作用位點[29-30],以及染色體過度表達或產生獲得性外排泵系統[31]。關于軍團菌對大環內酯類藥物的耐藥機制,目前研究有以下幾種情況。在由于外排泵的存在而導致耐藥性的研究中,Vandewalle-Capo等[9]在大環內酯類藥物濃度逐漸增高的情況下通過對軍團菌進行連續傳代,獲得了對阿奇霉素具有高水平耐藥性的軍團菌菌株,他們的研究結果顯示lpe AB外排泵的高表達賦予了軍團菌這種抗性[9]。lpe AB外排泵是發現于軍團菌的大環內酯類耐藥外排泵,以阿奇霉素為特異性底物。這種外排泵同源于大腸桿菌的Acr AB外排泵,是RND外排泵家族成員[22]。lpe AB操縱子上游序列的突變,導致了這種外排泵的過度表達。挪威研究人員Natas等[16]通過對搜集自臨床和環境中的共122個嗜肺軍團菌菌株進行了抗菌敏感性檢測并進行了全基因組測序,他們的研究結果表明對阿奇霉素敏感性降低的嗜肺軍團菌菌株,均存在lpeAB外排泵的高表達特性。

軍團菌對大環內酯類藥物敏感性降低也可以來自核糖體點突變,Descours等[11]通過對來自同一敏感菌株培育得到的12個獨立譜系進行全基因組測序,分析共有突變,發現嗜肺軍團菌對大環內酯類藥物耐藥性的增加與核糖體突變有關。其主要的突變位點是編碼L4、L22和23S r RNA的基因,rpl D或rpl V基因的點突變或插入、缺失等主要發生在進化過程的早期,它們影響了L4(Q62～G66)和L22(P87～G91)蛋白中兩個高度保守的5個氨基酸區域,這兩個區域位于大環內酯類藥物結合位點附近的核糖體出口隧道中的狹窄結構環上,影響了大環內酯類藥物與軍團菌核糖體的結合,造成了軍團菌對部分大環內酯類藥物的最低抑菌濃度出現輕度上升。耐藥機制產生的后期則主要是23S r RNA發生的突變,rrl基因突變使得選擇藥物的最低抑菌濃度出現大幅上升,這與肽基轉移酶區域內的4個核苷酸位點有關,即23S r RNA結構域V的2057、2058、2059和2611這4個位點。位點2058和2059是大環內酯類藥物結合的關鍵核苷酸,而堿基對2057和2611是負責關閉肽基轉移酶區域單鏈部分之前的莖。這些位置的核苷酸突變雖發生較晚,但導致了軍團菌對大環內酯類藥物的最低抑菌濃度明顯增加[11]。

(二)軍團菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制

氟喹諾酮類藥物主要通過抑制軍團菌的DNA促旋酶來干擾軍團菌DNA的復制,從而起到抑制軍團菌增殖生長的作用。Jonas等[32]在嗜肺軍團菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的體外選擇實驗過程中發現,嗜肺軍團菌出現對氟喹諾酮類藥物耐藥與gyr A基因發生突變有關,gyr A的第83位氨基酸序列出現T83K或T83I改變,與軍團菌出現對氟喹諾酮類藥物耐藥有關。Almahmoud等[10]在含有環丙沙星的培養基中通過連續傳代,得到8株耐藥性從低到高的軍團菌譜系。進行基因檢測,進一步發現在嗜肺軍團菌出現對氟喹諾酮類藥物的耐藥過程中,突變影響了拓撲異構酶Ⅱ編碼基因的gyr A、parC和gyrB三個位點。gyr A首先發生突變T83I,然后是parC中發生G78D或S80R點突變,最后gyr A中再次發生突變D87N得到相比初代菌株對莫西沙星濃度提高512倍的耐藥菌株。在Shadoud等[25]研究利用實時熒光定量PCR和二代測序技術,通過檢測來自住院和抗菌藥物治療期間的軍團病患者的呼吸道樣本,檢測患者標本中軍團菌對氟喹諾酮類耐藥基因含量的變化,證明了體內對嗜肺軍團菌gyr A83突變株的選擇與氟喹諾酮類抗菌藥物在患者體內的顯著增加有關,并且氟喹諾酮類藥物對嗜肺軍團菌的耐藥性選擇發生在藥物治療期間,該研究說明氟喹諾酮類藥物在臨床應用過程中可誘導軍團菌耐藥,并且其發生概率并不低。

綜上所述,關于環境及臨床軍團菌菌株對大環內酯和氟喹諾酮類藥物的耐藥國內外均有報道,雖然研究尚不多,但已觀察到臨床用藥過程中誘導耐藥的發生,值得臨床醫生關注。由于臨床標本分離軍團菌困難,菌株耐藥性難以判斷,個別重癥患者,即使應用了抗軍團菌藥物,仍未逆轉其不良預后。對于致死性病例,不良預后是否與藥物耐藥有關,有待于未來進行深入研究。在危重癥治療過程中,臨床醫生應關注耐藥情況的發生,有條件情況下可進行軍團菌培養,進而做藥物敏感性檢測。如無軍團菌分離培養的條件,可利用二代測序技術監測標本中相應耐藥基因的載量及其變化,分析患者體內軍團菌是否存在對特定藥物的耐藥突變[25]。當單藥治療失敗不除外耐藥發生時,聯合治療可能對預后有益。

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