外泌體在肝細胞癌發病中的研究進展*

閆冰冰 晁 旭 馮雪松 黃 峰△

1.陜西中醫藥大學 (陜西 咸陽， 712000) 2.陜西中醫藥大學基礎醫學院病理學教研室 3.陜西中醫藥大學基礎醫學院生物化學教研室

肝細胞癌(HCC)是世界上第三大常見的惡性腫瘤，占原發性肝癌的85%～90%[1]。HCC已發展成為全球范圍內最具致命性、侵略性和惡性程度最高的癌癥之一[2]。乙型肝炎病毒(HBV)感染被認為是中國HCC發病的主要危險因素[3]。雖然近年來研究出了新的HCC治療方式，但只有根治性手術切除才有可能治愈早期HCC。對于中晚期HCC，雖然已經開發了如索拉非尼等藥物來提高患者生存率，但是晚期肝癌患者的預后仍差，迄今為止尚無有效的治療方法[4]。外泌體是可以在細胞間轉運生物活性分子的膜結合囊泡，其大小約為40～100 nm[5]。通過多種生物分子調節細胞之間的微環境和免疫系統，不僅如此，這些外泌體還會通過“轉運”方式在細胞內空間交換和傳遞遺傳物質[6-8]。不僅如此，外泌體還參與腫瘤細胞的轉移、血管生成與正常細胞向腫瘤細胞的轉化。許多類型的細胞增加表明外泌體參與了腫瘤的發生、發展、轉移、免疫逃逸和耐藥性，其機理在于這些細胞如免疫細胞、間充質細胞和腫瘤細胞可能誘導了外泌體的釋放[2]。此外，腫瘤來源的外泌體含有大量與癌癥相關的血清學標志物，例如miRNA，可用于早期HCC的檢測。迄今為止，外泌體生理功能的研究仍未完全明確，本文綜述了外泌體的功能、結構及其對HCC的影響和臨床應用。

1 外泌體的來源和功能

外泌體最初被認為是具有網織紅細胞胞膜特征的紅細胞成熟“廢棄物”，有學者于1987年從綿羊網織紅細胞中分離出的囊泡[9]。隨著時間的推移，新的研究進展也逐漸證實了外泌體是通過將細胞膜與胞內多囊泡分離，然后釋放到細胞外空間而形成的小的磷脂雙層膜納米囊泡[10]。外泌體可以被任何細胞如B淋巴細胞、T細胞、肥大細胞、樹突狀細胞等合成，并可能被分泌到其他細胞中以實現其功能[11]。外泌體的密度約為1.13～1.19 g/ml[12]。外泌體含有蛋白質、RNA、DNA、膽固醇等大小從50～140 nm不等的生物活性物質[2]。淚液、尿液、母乳、血漿和細胞培養上清液等生物液體中存在大量外泌體[9]。新興證據表明，外泌體也可在腫瘤的生長過程中被分泌，例如，Yang等[13]研究表明長鏈非編碼核糖核酸(lncRNA HOTAIR)可誘導MVBs將其轉運至質膜，進一步促進HCC外泌體的釋放。

2 外泌體在CHB向HCC轉化過程中的作用

外泌體可以由一些星狀細胞、肝細胞和免疫細胞的正常肝細胞所分泌，與此同時，這些細胞外囊泡介導肝細胞之間的正常信息交流，維持肝內環境平衡[2]。有研究發現，肝硬化期、HCC早期和晚期的漿液外泌體含量均顯著高于正常肝、肝變性和肝纖維化，表明外泌體具有較高的能力可以運用于HCC的早期檢測與診斷中[14]。Li等[2]表明，當細胞被病毒感染時，外泌體參與了擴散、免疫調節和抗病毒反應。在中國，HCC發生的主要原因是慢性乙型肝炎(CHB), Kouwaki等[15]研究表明HCC可誘導外泌體miRNA-21和miRNA-29，抑制樹突狀細胞和巨噬細胞，釋放IL-12，而IL-12可激活自然殺傷細胞(NK)，從而破壞先天免疫應答。CHB的長期病史可能會帶來肝纖維化的影響，在接受特定的刺激下，肝星狀細胞(HSCs)會轉變為肌成纖維細胞，這與HCC的發生和肝纖維化的發病機制有關[16]。Zhou等[17]發現外泌體可以利用miR-214相互作用于細胞穿梭，從而調節結締組織生長因子2 (CCN2)的形成。隨著肝纖維化的活化，外泌體在肝干細胞中過表達CCN2，幾年后，肝纖維化將進展為HCC[2]。

3 外泌體與HCC的關系

隨著研究的不斷進展，越來越多的新興證據也可以表明，外泌體在HCC的形成與轉移過程中起著至關重要的作用，外泌體中的物質同樣可以用于臨床診斷和治療。

3.1 外泌體調節HCC的生長和轉移 外泌體可分泌miRNAs或其他物質，從而調節HCC的生長和轉移。HCC細胞分泌的miRNA-21使HSC中PDK1/AKT信號激活，進而將HSC細胞轉化為CAFs，活化的CAF分泌如基質金屬蛋白酶2(MMP2)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和轉化生長因子-β(TGF-β)等細胞因子，將進一步促進癌癥的發展[17]。此外，免疫細胞中的toll樣受體(TLR)與含有miRNA-21和miR-29a的外泌體在結合的情況下，可激活TLR中的NF-κB通路，從而分泌一系列炎癥因子，促進腫瘤的生長與轉移[18]。Fang等[19]發現包含miR-1247-3p的外泌體會導致CAF激活β1-整合素-NF-κB信號通路，而這種外泌體由高轉移性HCC細胞產生，最終CAF通過激活IL-6和IL-8進一步促進HCC的發展。Li等[20]在實驗中首次發現lncRNA FAL1在HCC外泌體中上調，同時可以轉移到其他HCC細胞中促進肝癌細胞的生長和遷移。除了HCC細胞，有些細胞同樣也可以分泌外泌體，從而促進HCC生長并減少DNA損傷。例如，Zhang等[21]在其研究中證實脂肪細胞可以通過降低miR-34a并激活腫瘤生長中的USP7/Cyclin A2信號通路來釋放外泌體環狀RNA(circRNAs)，減少DNA損傷。

3.2 外泌體對HCC血管生成的影響 HCC具有高度血管生成性，VEGF在HCC的發病過程中發揮了重要作用。最近的一項研究表明，間充質干細胞(MSC)衍生的外泌體通過下調VEGF抑制腫瘤血管生成，其是細胞間信息交流的重要介質[2]。Xue等[22]研究發現，由CD90+HCC分泌的外泌體可以在經過lncRNA H19的高表達后，上調VEGF及VEGF-R1的轉錄，從而誘導腫瘤血管生成。Lin等[23]發現HCC細胞分泌的外泌體中存在的miR-210，可以通過靶向SMAD4和STAT6轉移到內皮細胞中，從而促進腫瘤血管生成。Yukawa等[24]發現HepG2外泌體表達NKG2D(一種免疫細胞的活化受體)和HSP70(一種與壓力有關的熱休克蛋白)，兩者都作用于VEGF受體，引起腫瘤血管生成。Fang等[25]發現HCC分泌的外泌體中miR-103促進HCC轉移，其是通過作用于內皮細胞增加血管通透性來完成的。Lee等[26]研究發現，隨著真核翻譯起始因子3亞基C(EIF3C)的表達，HCC細胞分泌外泌體的能力也逐漸增強，繼而引起腫瘤生長，最終導致腫瘤血管生成。

3.3 外泌體參與HCC上皮-間質轉化(EMT) 上皮-間質轉化(EMT)主要是指上皮細胞間連接的破壞和極性的喪失，從而轉化為具有間質表型的細胞[27]。對于HCC來說，EMT在其發生發展中起至關重要的作用，在EMT期間，上皮細胞被迫獲得干性、侵襲性、向遠處器官轉移的能力以及耐藥性的間質表型特征[28]。EMT在促進HCC的侵襲和轉移中起著重要作用[29]。Tang等[30,31]提出了體外實驗CTNND1促進細胞增殖、遷移和體外侵襲，并通過CTNND1在體內促進HCC細胞腫瘤形成和轉移。根據更徹底的分析，與人肝癌標本中的β-catenin，WNT11，Cyclin D1和BMP7表達相比，CTNND1的表達具有強烈的關聯性。他們還發現，CTNND1間接增強Wnt /β-catenin信號傳導，從而促進HCC轉移。

3.4 外泌體與HCC免疫調節的關系 利用免疫細胞靶向腫瘤是醫學研究的一項熱點。在Lu等[32]最近進行的一項研究中，富含AFP的外泌體引發了特異性的抗腫瘤免疫反應，為治療HCC提供了一種新的無疫苗方法。Rao等[33]還報道了源自HCC抗原的外泌體相比細胞裂解物能引起更強的免疫應答。發現使用小鼠細胞來源的外泌體對HCC進行治療時，腫瘤免疫微環境可有明顯改善，例如T細胞和γ-IFN的水平增加，IL-10和TGF-β的水平下降。由此可以得出結論，由HCC抗原表達的腫瘤細胞外泌體可能會觸發DC中強烈的免疫反應，從而改善HCC的免疫微環境。已有研究證明，巨噬細胞在通過經典激活途徑刺激脂多糖(LPS)和γ干擾素(IFN-γ)后，可以分化為M1型，發揮促炎、抗腫瘤作用，或通過選擇激活途徑，經IL-4 刺激分化為 M2 型，發揮抗炎、促腫瘤作用。在HCC從早期發展到晚期的過程中，TAMs從M1表型轉變為M2表型，目前認為TAMs以M2型為主，作為與HCC相關炎癥的關鍵因子，它們通過釋放如IL-8、IL-10、TGF-β等各類細胞因子，抑制有效的抗癌免疫、刺激血管生成和EMT來促進腫瘤生長和轉移[34，35]。

3.5 外泌體在HCC診斷和預后中的應用 由于腫瘤的時間異質性和空間異質性，傳統的組織標本活檢方法已經無法獲得腫瘤組織完整、動態的信息，“液體活檢”技術克服了傳統組織活檢的缺點，由此應運而生。在磷脂雙層膜的保護中，外泌體物質不能被任何酶降解，因此外泌體被認為是一種合適的診斷工具。由于外泌體具有許多可以由腫瘤細胞表達的獨特物質，因此可以將它們用于腫瘤的早期檢測。Pa等[36]收集了345例HCC、93例肝硬化、46例慢性肝炎和1 033位健康人的血清樣本，通過使用miRNA微陣列分析，發現了其在Ⅰ期也能保持診斷的準確性，這說明血清中的miRNA可作為準確檢測HCC的生物標志物。Li等[2]在研究中提到Won Sohn等發現HCC患者外泌體中miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224的水平低于HBV患者，表明這3種miRNA可以作為檢測HCC的新的血清標志物。另一項研究還報道了miR-29b，miR-30d和miR-140在HCC患者的生存中具有重要意義，因此，這些對晚期HCC的治療起指導作用的外泌體miRNA可以作為HCC的預后生物標志物[37]。Xu等[38]認為，血清外泌體RNAs ENSG00000258332.1和LINC00635聯合血清AFP可能是診斷和預后HCC的有前途的方法。除miRNA外，越來越多的研究證實，lncRNA在許多腫瘤中都具有差異性表達，能夠作為輔助腫瘤早期診斷的分子標志物,牛磺酸上調基因(TUG1) 是一種進化上高度保守的lnc RNA，Yu等[39]研究發現TUG1能夠促進肝癌細胞的增殖能力，這表明TUG1對于肝癌細胞具有促癌作用。其他實驗也支持外泌體lncRNA可作為HCC的預后因子，與正常的相比，lncRNA在HCC患者中顯著上調，具有良好的穩定性和特異性[40]。除lncRNA外，circPTGR1在97 L和LM3細胞的外泌體中特別表達，并在HCC患者的血清外泌體中增加，Wang等[41]指出，它可以用于HCC的臨床分期和預后。

3.6 外泌體在HCC治療中的應用 HCC對普通化療不敏感，miR-122可以增強肝癌細胞對化療藥物的敏感性，外泌體作為一種具有低毒性、低免疫原性以及高生物相容性等特征的miRNAs的生物載體[42]。同時，MSC可以分泌大量的外泌體，研究人員發現，將miRNA-122轉染到由MSC形成的脂肪來源的間充質干細胞中，可以產生含有miRNA-122的外分泌體，從而增強癌細胞對化療的敏感性并改善miR-122靶基因的表達[43]。Wang等[44]發現，miR-335-5p可以由星狀細胞衍生的外泌體裝載，值得肯定的是miR-335-5p能夠被引入肝癌細胞中抑制腫瘤生長和轉移，從而為HCC提供了新的治療策略。

4 結語與展望

外泌體對于HCC有重要作用，它參與了HCC的發生、發展和轉移，為HCC的治療提供了新的思路。不僅如此，外泌體中的許多物質都可以用作新的生物標志物，這對于改善HCC的早期診斷具有重要意義。隨著醫學界對外泌體研究的不斷深入，外泌體成功應用于早期HCC的臨床診斷與治療將指日可待。