新型冠狀病毒病原學特點和診斷方法的研究進展

魏家豪 王自棟 閻錫新

河北醫科大學第二醫院呼吸與危重癥醫學一科,石家莊050000

新型冠狀病毒具有較強的傳播性[1]。同屬冠狀病毒的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒 (severe acute respiratory syndro me coronavirus,SARS-Co V)和中東呼吸系統綜合征 冠 狀 病 毒 (Middle East respirator y syndr o me cor onavir us,MERS-Co V)能夠引起嚴重急性呼吸綜合征和中東呼吸系統綜合征,曾分別在2002年和2012年出現并造成流行。SARS-Co V 造成8 096例感染和774 例死亡[2],MERS-Co V 造成2 494例感染和858例死亡[3]。2020年2月11日,WHO 宣布將新型冠狀病毒感染所致疾病正式命名為COVID-19,同時國際病毒分類學委員會又將新型冠狀病毒正式命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndro me cor onavir us 2,SARSCo V-2),并認定其是SARS-Co V 的姊妹病毒。COVID-19患者的病情嚴重程度差異較大,臨床表現亦無明顯特異性。輕型患者僅表現為低熱、輕微乏力等癥狀,無肺炎表現,而重癥病例可出現呼吸困難或低氧血癥,嚴重者可快速進展為ARDS、膿毒癥、休克及多器官功能障礙綜合征,甚至死亡。

WHO 分 別 于2020 年1 月30 日 和3 月11 日 宣 布COVID-19為突發公共衛生事件和世界大流行。截至2021年3月27日,全球累計確診病例1.2億余例,死亡病例逾270萬。疫情期間,SARS-Co V-2的病原學研究不斷開展,使得研究人員對病原體的認識不斷豐富。研究人員根據病原學特點和疾病特征開發出新的診斷方法,從疫情初期應用的基因測序,逐漸發展出PCR、以影像學為主的臨床診斷方法和血清學試驗,使得對確診病例診斷的敏感性不斷提高。通過科學的診斷、規范的治療和精準的防控,國內疫情歷經幾次波折后目前已得到控制,但境外疫情仍持續擴散蔓延。

1 病原學

COVID-19疫情暴發初期,多家研究機構相繼在患者支氣管肺泡灌洗液中采集病毒并進行分離和培養,完成了病毒的全基因組測序[1,4-7],獲取了病毒的詳細信息,并對已知的病毒信息進行對比。

1.1 SARS-Co V-2的分類 SARS-Co V-2與SARS-Co V 均屬于β冠狀病毒的sar becovir us亞屬,是一種單正鏈RNA病毒,其基因全長約為29 900個堿基對,有較高的突變率。多家研究機構通過基因同源性檢索發現SARS-Co V-2與β冠狀病毒屬的SARS 樣冠狀病毒密切相關,SARS-Co V-2和bat-SL-Co VZC45、bat-SL-Co VZXC21、Pangolin-Co V 及Ra TG13的全基因組序列一致性分別為87.99%、87.23%、91.02% 及96.2%, 而 SARS-Co V-2 同 SARS-Co V 和MERS-Co V 的序列一致性僅約為79%和50%[4-8]。

1.2 SARS-Co V-2的形態和結構 中國疾病預防控制中心通過透射式電子顯微鏡發現,SARS-Co V-2 常呈球形或橢圓形,也可為多形性,直徑約為60～140 n m,表面有很多長度約9～12 n m 的刺突蛋白[6]。

SARS-Co V-2基因編碼非結構蛋白和4 種結構蛋白,結構蛋白分別為刺突蛋白 (S)、病毒包膜 (E)、基質蛋白(M)和核蛋白 (N)[9]。非結構蛋白主要由其基因組中的開放閱讀框1ab (open reading frame 1ab,ORF1ab)編碼,其中RNA 依賴的RNA 聚合酶負責病毒RNA 的合成,而主蛋白酶則是參與蛋白質加工的關鍵酶,二者是病毒復制中重要的非結構蛋白,因此成為抗病毒藥物的重要靶點[10-11]。上述蛋白的相應基因在SARS-Co V-2基因組中自5'端開始的順序為ORF1ab、S、E、M 和N,這些蛋白對應的核酸堿基序列經常作為PCR 檢測的靶點。

SARS-Co V-2包膜上的S蛋白介導受體結合和膜融合,在決定病毒的嗜性和傳播能力方面起到關鍵作用,也是中和型抗體的重要靶點和疫苗設計的關鍵位點[4,12-13]。其中,S蛋白在功能上通常分為S1亞基和S2亞基,S1亞基負責識別和結合細胞表面受體,S2 亞基負責細胞膜融合。SARS-Co V-2和SARS-Co V 的S蛋白受體結合區域的結構具有相似性,共同使用血管緊張素轉換酶2 (angiotensin converting enzy me 2,ACE2)作為細胞受體,并且Zhou等[1]和Walls等[12]的體外實驗和血清學試驗也支持這種可能性。但SARS-Co V-2和SARS-Co V 的S蛋白某些氨基酸殘基不同,導致兩者的S 蛋白和ACE2 的親和力也不同。疫情早期,Shang 等[13]和Wrapp 等[14]的研究數據表明SARS-Co V-2的S蛋白對人ACE2 的親和力更高,而且S蛋白對人ACE2的高親和力可能促進了SARS-Co V-2在人群中的傳播。此后,Kor ber 等[15]的研究進一步發現,SARS-Co V-2的S蛋白S1 亞基D614G 位點突變增強了病毒的傳播性。N 蛋白與病毒RNA 結合形成核糖核酸蛋白;E蛋白參與了病毒的組裝和出芽,并參與離子通道的形成,M 蛋白也參與了病毒顆粒的組裝。此外,Sun等[16]通過酶聯免疫吸附試驗證實病毒S蛋白和N 蛋白都能夠誘導產生特異性抗體,其中Ig G 和Ig M 的血清學測定能夠用于COVID-19的診斷和預后的評估。

1.3 SARS-Co V-2的致病機制 SARS-Co V-2通過S蛋白侵入細胞,而肺臟內的ACE2主要表達在Ⅱ型肺泡上皮細胞[17]。SARS-Co V-2通過ACE2侵入組織后,中性粒細胞和單核/巨噬細胞等固有免疫細胞滲出,此外重癥患者體內的多種免疫細胞還可以產生大量促炎性細胞因子,引起“細胞因子風暴”,促進了ARDS的發生[18-19]。Blanco-Melo等[20]進行的體外實驗、動物實驗和臨床研究也顯示病毒復制誘導了趨化因子和IL-6等細胞因子高表達;SARS-Co V-2的基因產物抑制了宿主生成IFN-1和IFN-2的反應性,導致免疫應答受阻,致使病毒的高復制難以得到控制。其中,伴有基礎疾病和高齡等免疫力低下患者容易發展為重癥病例可能與此有關。Huang等[21]的臨床研究為上述觀點提供了依據,他們發現患者的IL-2、IL-7、IL-10、粒細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子α等細胞因子都可以升高,而且重癥患者血漿中的促炎性細胞因子水平往往較非重癥患者高。《新型冠狀病毒肺炎診療方案 (試行第七版)》[22]開始把外周血IL-6和C-反應蛋白等外周血炎癥因子作為在重型、危重型的臨床預警指標。此外,口腔黏膜上皮細胞、食管復層上皮細胞、回腸和結腸的腸上皮細胞、膽管細胞、心肌細胞、腎近端小管細胞和膀胱尿路上皮細胞中均有ACE2的高表達,患者出現胃腸道癥狀和肝功能異常等表現,可能是由于病毒感染胃腸道和膽管上皮細胞引起功能障礙等原因所致。SARS-Co V-2 除感染人類之外,Shi等[23]通過研究發現白鼬和貓極易感染SARS-Co V-2,狗的易感性較低,而豬、雞和鴨等畜禽則不易感染SARS-Co V-2。

2 臨床特征

COVID-19患者發病癥狀差異較大。疫情早期,由鐘南山院士牽頭的COVID-19高級專家組和中國疾病預防控制中心開展的兩項臨床研究[24-25]顯示患者癥狀發生率相似,癥狀包括為發熱 (88%)、干咳 (68%)、乏力 (38%)、咳痰 (34%)、氣短 (19%)、肌痛或關節痛 (15%)、咽痛(14%)、頭痛 (14%)、寒顫 (11%)、惡心嘔吐 (5%)、腹瀉 (4%)、鼻塞 (5%)、咯血 (1%)和結膜充血 (1%)等;在實驗室檢查中,淋巴細胞減少和C-反應蛋白升高常見,也可見血小板和白細胞減少。COVID-19 患者影像學表現常為磨玻璃樣影、斑片狀陰影、小葉間隔增厚及實變,累及雙側多個肺葉,多分布于背側和外周[24,26]。COVID-19患者缺乏特異性臨床表現,因此對疑似患者進行確診往往還需要借助特異性實驗室檢查。

3 診斷方法演進

疾病快速診斷及無癥狀感染者的發現對于疫情的防控和救治至關重要。國內外機構圍繞患者實驗室診斷試驗及患者影像學特征開展了大量研究。隨著對病原學和疾病認識的加深,診斷方法最初從單一的基因測序,逐漸發展出了PCR、影像學方法為主的臨床診斷和血清學試驗。

3.1 基因測序 第二代基因測序技術 (next-generation sequencing,NGS)可以應用于感染性疾病的臨床診斷,特別是在傳統診斷方法受到制約和檢測罕見微生物方面,NGS不僅能夠對患者的臨床樣本進行微生物的檢測和生物學分型,還能夠在流行病學、進化追溯、易感因素預測、毒力和耐藥性測定方面發揮作用[27]。

疫情初期,研究人員對新病原體的了解相對局限,缺乏SARS-Co V-2基因序列和引物等相關信息,NGS在病原體檢測中發揮了重要作用。除確診病例具備流行病學史和相應臨床表現外,國內的研究往往先進行血清學試驗或PCR 排除常見呼吸道病原體感染,然后應用NGS 進行病原學檢測和診斷,測序結果需與SARS-Co V-2 高度同源[4-7]。而且,NGS與隨后推廣的PCR 技術對COVID-19的診斷具有良好的一致性,近期Papoutsis等[28]的一項小型研究結果顯示,癥狀患者的糞便樣本行全基因組NGS與鼻咽分泌物行PCR 的結果一致率為100%。此外,該研究在4例患者的NGS測序結果中檢出33種不同的突變。但是在臨床采集的樣本中病毒核酸的含量較低,而宿主的基因片段占據了大部分,這種情況降低了NGS對病原體檢測的敏感性。NGS在疫情初期能夠快速地投放應用,在檢測新發病原體方面獲得了較為全面的病原學信息,但是NGS對樣本和技術手段要求較高、流程較慢、耗資較高,難以在疫情暴發階段大規模開展。然而,NGS在SARS-Co V-2毒株監測方面卻舉足輕重。Motayo等[29]通過對NGS測序結果進行分析,將SARS-Co V-2分為不同的譜系和亞譜系并簡要描述了毒株的流行狀況。

3.2 分子生物學實驗 PCR 和NGS都屬于分子生物學技術,能夠為COVID-19的診斷提供病原學證據,其中PCR通過將特定的核酸片段進行指數式擴增,能夠在不相關核酸較多的臨床樣本中檢測出特定病原體的微量核酸,具有較高的敏感度。PCR 能夠快速、經濟、可靠地檢測病毒核酸,完成一次PCR 和NGS分別耗時3 h和24 h[30]。

2020年1月21日,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所發布實時熒光RT-PCR 的引物和探針,選擇SARS-Co V-2 ORF1ab和N 2個基因區域作為檢測靶點[31]。1月23日,國家衛生健康委員會公開發布 《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案 (試行第三版)》[32],明確提出了疑似病例需同時具備流行病學史和相應臨床特征,確診病例需通過RT-PCR 或基因測序尋找病原學證據。此后,Peng等[33]發現患者血液、尿液和呼吸道及消化道標本等多種樣本經PCR 檢測呈陽性,并且后續版本的診療方案增加了血和糞便樣本,并強調檢測下呼吸道樣本更為準確。這是因為患者不同類型的樣本中的PCR 檢測陽性率不同。Wang等[34]進行的一項多中心臨床研究顯示支氣管肺泡灌洗液標本陽性率最高可達 (93%),其次痰 (72%)、鼻拭子(63%)、纖維支氣管鏡刷檢 (46%)、咽拭子 (32%)、糞便 (29%)和血 (1%)。但是Peng等[33]的研究指出糞便和尿液樣本病毒RNA 陽性時并不一定具備胃腸道和尿道癥狀。Wu等[35]的研究顯示糞便樣本對SARS-Co V-2核酸的陽性反應通常滯后于呼吸道樣本,呼吸道病毒清除后患者消化道仍可能存在病毒復制。近期,越來越多的入境檢測哨點開始采集肛拭子。這項舉措在最近Lin等[36]的報道中找到了依據,該研究發現盡管肛拭子在病程早期采集的病毒載量低,但是肛拭子陽性的持續時間長,檢測肛拭子能夠幫助篩檢持續排毒患者,有助于疫情防控。然而,上述兩項研究也體現出了PCR 存在一定程度的假陰性率。總之,PCR 較NGS 流程簡便、耗資較少、特異度高,根據核酸片段即可診斷,但是不同患者在不同病程階段、不同樣本間的一致性較差。不可忽視的是,不同類型的標本檢測PCR 還具有監測病情變化和評估預后的潛在臨床價值。

3.3 以影像學方法為主的臨床診斷 胸部影像學技術,特別是胸部CT,能夠在COVID-19病程早期敏感、客觀地評估病變的性質和范圍,監測病情變化。盡管COVID-19患者的影像學表現不具有明顯的特征性,但是胸部CT 一直是其診斷的重要手段,特別是在疫情的特殊階段。

2020年1月30日,WHO 宣布COVID-19為國際關注的突發公共衛生事件,疫情累及18 個國家或地區,境外82例感染,國內7 736例。2月4日國內確診病例新增3 887例 (湖北3 156例),現存疑似病例23 260例,國內新增病例達到峰值,疫情在全國范圍內短期快速播散,遠遠超出當時我國核酸檢測能力。而且許多患者不具備流行病學史,這使得流行病學史與核酸檢測在診斷中的作用下降。因此,2月4日,國家衛生健康委員會發布的 《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案 (試行第五版)》[37]強調了影像學診斷的重要性。在湖北以外,如果患者的影像學表現等相關臨床證據均符合COVID-19特征,疑似病例的診斷則不再要求流行病學史,確診病例仍要求PCR 或基因測序。而在湖北省內,有發熱或呼吸道癥狀、血常規改變和流行病學史的兩項可診為疑似病例。在此基礎上具備病毒性肺炎影像學特征即可作為臨床診斷病例,具備病原學證據則診斷為確診病例。Xie等[38]對177例確診病例進行了回顧性研究,5例患者初次核酸檢測陰性,但是胸部CT 具備COVID-19影像學的典型表現,7例患者PCR 呈陽性而影像學不具有病毒性肺炎的表現。Fang等[39]的回顧性研究納入了51例確診患者,其中50例胸部CT 有病毒性肺炎等異常表現,僅36例初次PCR 呈陽性,CT 的敏感度 (98%)顯著高于PCR (71%)。鐘南山院士團隊在疫情早期的研究顯示仍有17.9%的非重癥患者和2.9%的重癥患者影像學未見肺炎表現[24]。由此可見,影像學具有較高的敏感度,然而并非所有患者均具備典型影像學表現,單純依靠PCR 或影像學診斷COVID-19并不嚴謹,2種診斷方法結合應用應該會更為準確。但在暫時缺乏核酸結果的情況下,影像學特征性表現與臨床思維相結合可以明顯提高的COVID-19 診斷水平。

3.4 分子生物學實驗和血清學試驗聯合診斷 隨著對病原體結構蛋白認識的不斷加深和診斷方法的逐步完善,有學者認為血清學試驗可以作為核酸檢驗的補充,血清學試驗本身具備快速、簡單、敏感、準確、穩定的特點,易于大規模開展和追溯既往感染。PCR 和血清學試驗兩者聯合應用能提高敏感度。

Sun等[16]通過酶聯免疫吸附試驗分析了38例患者的血液樣本,證實S蛋白和N 蛋白分別能夠刺激機體產生特異性Ig G 和Ig M 抗體,并且聯合監測S蛋白和N 蛋白的Ig G和Ig M 抗體陽性率在1周內可達75%,因此血清學試驗有助于COVID-19的早期診斷。國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案 (試行第七版)》[22]第一次提出進行確診可以依據血清學證據,即血清SARS-Co V-2特異性Ig M 和Ig G 陽性及Ig G 的動態變化,結合臨床疑似病例條件可以確定診斷,但也指出血清學不能單獨作為COVID-19診斷依據。Zhao等[40]通過納入173例患者縱向動態觀察Ig M 和Ig G 的血清學轉換,發生的中位時間分別為發病后12 d和14 d。

血清學試驗不受呼吸道樣本的不確定性影響,能夠減少核酸檢驗中因采樣、試劑盒質量、樣本RNA 降解及檢測的性能引起的假陰性,已經有多項研究報道患者PCR 出現假陰性而血清學試驗呈陽性[41-42]。Li等[43]通過側流免疫分析技術對39例確診患者和128例非COVID-19患者進行血清學檢測,結果顯示Ig M 和Ig G 檢測的總體敏感度為88.66%,特異度為90.63%。此外Pan等[41]應用膠體金免疫層析技術進行Ig M 和Ig G 聯合檢驗,血清學試驗的敏感度在1～7 d、8～14 d和15 d后分別為11.1%、92.9%和96.8%。而且該兩項研究認為靜脈血、指尖血、血清和血漿的檢測結果具有良好的一致性[41,43]。上述研究顯示,COVID-19患者發病早期核酸陽性率較高而后期下降,而血清學試驗隨著病程發展陽性率提高。盡管如此,在Mei等[44]報道的一項納入651例康復患者的臨床研究中,23例核酸復陽患者行抗SARS-Co V-2免疫球蛋白的膠體金免疫層析試紙檢測,其中7例患者Ig M 和Ig G 均陽性,5例患者Ig G 陽性但Ig M 陰性,其余11例患者2種抗體均陰性。由此可見,血清學試驗在長期的角度上并非完全可靠,因此,核酸檢驗和血清試驗學聯合診斷COVID-19 準確性較高。

4 結論和展望

研究人員借鑒先前的冠狀病毒病原學的研究成果,及時開展SARS-Co V-2的病原學研究。新發病原體認識的不斷完善促進了新的診斷方法的開發,同時更多的診斷方法在診療方案的更新中被采納,提高了確診標準的敏感度。單一的診斷方法難以準確地判斷患者是否被SARS-Co V-2感染,因此對COVID-19患者進行確診需要參考多種診斷方法。未來可以進一步深入病原學和感染機制研究,不僅能夠為診斷方法提供更多參考,還能夠推動疫苗和抗SARS-Co V-2藥物的開發。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突